SDA

来的食品行业对检测的需求，对食品中致病菌的检测迫切需要更多快速、简便、特异的检测技术以满足人们对食品的更高需求。

分子检测技术是20世纪70年代末迅速发展起来的一项利用现代分子生物学和分子遗传学的技术，从DNA/RNA水平检测、分析基因的存在从而检测目标序列。核酸扩增是基因诊断技术中最常用的方法之一。目前核酸扩增的方法很多，分为两大类：以PCR为代表的核酸非等温扩增技术和核酸等温扩增技术。与PCR技术相比，核酸等温扩增技术的特点是可以在特定的温度条件下实现核酸的扩增。由于核酸等温扩增反应的全过程均在同一温度下进行，所以它对仪器的要求大大简化了，大大缩短了反应时间，可通过加热模块、水浴槽等简单的，甚至是非专业的设备来完成反应。因此，核酸等温扩增反应更能满足现代分子检测技术“快速简便”的需求，具有较大的实际应用价值。

二、相关领域国内外技术现状、发展趋势及国内现有工作基础

食品中病原菌传统检测方法繁琐、耗时长，一般3-5天才能检出病原菌。随着分子生物学技术的发展和应用，PCR等核酸扩增技术以其快速灵敏和特异的优势，不仅日益取代了传统的检测方法，而且使以往无法完成的检测成为了可能。针对一些检测特异性病原体的方法，试剂盒已经被开发，并取代了病原体体外培养等传统的微生物检测方法。 然而应用于常规检测，PCR技术始终无法摆脱依赖精良仪器设备的局限，使得以PCR为基础的核酸扩增技术无法更加广泛地推广和应用。

近年来，随着核酸扩增技术的发展和应用，以核酸等温扩增为基

础的检测技术得到了迅猛发展。多种机制的等温技术不仅诞生了，而且有些已经相当成熟，完成了从实验室到实际应用的过渡，正逐步在分子生物学、医学、法学、食品检测等领域广泛运用。特别是在现场快速检测技术方面，核酸等温扩增技术显示了其突出的优越性。更为重要的是，由于核酸等温扩增技术不需要温度变化的过程，且摆脱了对精良仪器设备的依赖，所以，病原体的检测实现了快速、简便和高通量。在实际操作和仪器要求方面，这些等温技术都比PCR技术更为简单和廉价，从而更容易被开发成现场检测的应用产品。 因此，等温扩增技术是核酸扩增技术的发展方向，具有广阔的应用前景。

链替代扩增（strand displacement amplification, SDA）是一种新的DNA体外等温扩增技术。该技术利用限制性核酸内切酶和具有链置换活性的DNA聚合酶，在等温条件下使靶序列在短时间内呈几何倍数级联扩增。目前，该技术还处于其发展和应用的初级阶段。然而，SDA技术灵敏、特异和简单的显著特点，赋予了该技术巨大的发展和应用前景。另外，将荧光检测技术引入SDA，不仅可以大大提高检测的灵敏度，而且还可以实现靶序列的定量测定。

SDA是一个全新的核酸等温检测技术。与其他技术相比，SDA有以下优点：在同一个温度条件下完成反应，避免了使用价格昂贵的PCR温度循环仪，可在偏远的基层单位使用；引物设计简单，与普通引物设计无异；快速高效，整个扩增反应可以在2 h内完成；可以实现高通量扩增检测；可同时检测DNA及RNA；原理简单，无需专门人员，易于基层推广应用；工艺易于实现，容易实现产业化。

目前，国内外SDA技术检测病原菌的报道较少，SDA技术检测食品病原菌未见报道，SDA技术检测食品病原菌的试剂盒亦未见报道。

三、项目目标及主要任务

（一）项目目标：

1建立SDA扩增方法

2建立SDA技术检测食品中常见病原菌的方法（沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、阪崎肠杆菌）

3开发出SDA技术检测食品中常见病原菌的试剂盒 4建立SDA技术检测食品中常见病原菌的方法标准 （二）主要任务：

1、SDA扩增方法的建立

（1）设计两对引物（B1、B2和S1、S2）。 （2）选择合适的限制性核酸内切酶和SDA聚合酶。

（3）优化反应体系，对引物、限制性核酸内切酶、SDA聚合酶温度、时间等因子进行优化，建立SDA方法。

（4）对SDA扩增方法进行评价。 2、SDA技术检测食品中常见的病原菌

（1）确定靶基因，设计不同的扩增引物对，测试引物的特异性，确定适宜的引物。

（2）研究食品中病原菌DNA的高效提取方法，拟采用热裂解、

FTA膜、溶剂提取酶解法、溶剂提取热裂解法等方法提取病原菌DNA。

（3）通过优化反应条件建立SDA法检测食品病原菌的方法。 （4）检测纯菌和人工污染的食品，确定SDA法的灵敏度和检出限。

（5）检测实际样品，确定SDA法的敏感性、特异性和符合率，对检测方法做出评价。

3、SDA检测食品中常见病原菌试剂盒的开发

（1）SDA检测试剂盒质量控制技术、检测效果评价和质量标准的建立

原辅料、半成品、成品质量控制，制定质量标准。确定稳定性和保质期。对试剂盒的检测效果进行评价，确定敏感性、特异性和符合率。

（2）试剂盒的应用

将试剂盒大规模应用于食品病原菌检测，并对其大规模应用效果进行评价。

（3）SDA检测食品中常见病原菌方法标准的制定 制订SDA技术检测食品中六种常见病原菌的方法标准。 （三）项目的技术关键、技术难点、创新点

1、 技术关键：设计扩增引物（B1、B2和S1、S2），优化反应体系，建立SDA扩增方法。

2、技术难点：建立SDA扩增方法。