冰冻切片免疫组化步骤

冰冻切片免疫组化步骤

1. 需要准备的材料

APES包被的载玻片 PBS（pH7.4） 4%多聚甲醛

PBST（含Tween-20）

PBST-G（含0.3mol/L甘氨酸）

2. 冰冻切片

取出组织块放于软塑料盖或特制的小盒内，之后将其缓慢平放于盛有液氮的小杯内，让盒底部接触液氮（小盒及组织块切勿浸入液氮内），大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置于-80℃冰箱储存备用，或置于恒温切片机冰冻切片。

切片厚度4-8 um (5 um)，对于免疫组化的需要用APES包被的载玻片，以增加组织片的粘附性。

切片后如不立即染色，必须吹干，储存于低温冰箱内保存。

3. 免疫组化染色步骤

固定：取出切片，室温放置5mins。用4%的多聚甲醛PBS溶液室温固定15mins，PBS冲洗三次（冲洗可以采用侧斜淋洗，也可至于平皿中摇晃）。

打孔：如果是需要染细胞内的蛋白，用曲拉通（TritonX-100）打孔：组织样品浸于含0.25% TritonX-100的PBS中10mins，之后用PBS洗3次，每次5mins。如果是染膜蛋白的，不需要曲拉通打孔。

封闭：将组织置于含1%BSA的PBST溶液中30mins，封闭非特异性粘合的抗体。对于多聚甲醛固定并进行免疫荧光的样本，在封闭缓冲液中加入0.3mol/L的甘氨酸。

孵化：组织样本浸于一抗（用含1%BSA的PBST稀释），放于湿盒中，室温1h或4℃过夜。用PBS洗3次，每次5mins。

浸入二抗（1%BSA的PBST溶液），室温1h。PBS洗3次，每次5mins。

染色：浸入0.1-1ug/mL的DAPI或Hoechst中，染色1min，PBS淋洗三次。 封片：用盖玻片封片，指甲油固定，保存与4或-20℃。