微生物大小和数量的测定

微生物大小和数量的测定

一．实验目的

1. 了解显微镜测定微生物大小与血球计数板测定微生物数量的原理。

2. 学习并掌握显微镜下测定微生物细胞大小的技术，包括目镜测微尺、镜台测

微尺的校正技术与测定细胞大小的技术。

3. 了解血球计数板的结构，学习并掌握血球计数板计数微生物数量的技术。

二．实验原理

1. 微生物大小的测定

微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小、只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。

（1） 目镜测微尺（图1）

目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。

图 1 目镜测微尺 图2 镜台测微尺

（2） 镜台测微尺（图2）

镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 2. 血球计数板测定微生物数量

镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质常不

易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(Petroff Hausser)细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。

血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网(图3)。每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成(图3)。

每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为

2

1／400mm，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室(大方格)的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为l／4000mm3。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。

图3 血球计数板的构造

三. 实验材料 1. 菌种

酵母菌液，枯草芽孢杆菌斜面培养物。 2．试剂

美兰染液，结晶紫，蒸馏水等。 3．仪器

显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸，酒精灯等。 四. 操作步骤

1． 目镜测微尺的校正

把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看

清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长l0μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。

用此法分别校正在物镜倍数为10×，40×，100×下目镜测微尺每小格所代表的长度。 （注意事项：由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。） 2． 细胞大小的测定 (1)酵母菌的大小测定

① 取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。

② 移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高 倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的直径各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的直径。

(2)枯草芽孢杆菌的大小测定

① 将载玻片洗净晾干后，在其中央滴一滴蒸馏水，然后通过无菌操作用接种针

取少量枯草芽孢杆菌的斜面培养物于蒸馏水中，然后干燥 ② 单染色

用结晶紫染液或美兰染液对其进行单染色，染色一定时间后冲洗载玻片的背面，将染液冲洗掉

③ 置于显微镜下镜检，用目镜测微尺测量枯草芽孢杆菌的长和宽 （注意事项：测量菌体大小时要在同一个标本片上测定3个大小相近的菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。） 3. 酵母菌菌悬液中酵母菌菌数的测定

(1)取洁净的血球计数板一块，在计数室上盖上一块盖玻片。

(2)将酵母菌菌悬液充分摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的右上角滴入一小滴(不宜过多)，使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌液。 (3)先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。

(4)计数时用16中格的计数板，要按对角线方位，取左上、左下、右上、右下的4个中格(即100小格)的酵母菌数。如果是25中格计数板。除数上述四格外，还需数中央1中格的酵母菌数(即80小格)。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏。如菌体位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

(5)凡酵母菌的芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复分数2-3次(每次数值不应招差过大，否则应重新操作)，取其平均值，按下 述公式计算出每毫升菌液所含酵母菌细胞数（25中格）。

(6)血球计数板用后，在水龙头上用水柱冲洗干净，可以用去污粉洗净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或吹风机吹干。

五. 实验结果

1、目镜测微尺的标定结果 物镜倍数 目镜测微尺的格镜台测微尺的格目镜测微尺的每（目镜均为10倍） 数 数 格的长度（μm） （小格） （小格） 10倍 100 99.8 9.98 40倍 100 24.8 2.48 100倍 100 9.6 0.96 2、 酿酒酵母的大小测定结果（10×40） 菌号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值 直径(μm) 4.96 4.216 3.72 2.976 3.72 3.968 3.224 2.976 3.968 3.72 3.745 酵母菌平均大小为3.745μm。

3、 枯草芽孢杆菌大小测定结果（10×100，油镜下） 菌号 1 2 3 平均值 长（μm） 3.072 宽（μm） 0.768 3.552 0.576 2.668 0.864 3.097 0.736 枯草芽孢杆菌大小平均值为3.097μm×0.736μm。

4、血细胞计数板对酿酒酵母悬液计数结果(算入分生孢子) 实验稀释各中格中菌数 菌数(个/mL) 次数 倍数 1 10倍 53 50 49 71 50 1.365×10^9 2 8倍 103 91 79 84 98 1.82×10^9 六．思考题 1、为什么更换不同放大倍数的目镜和物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？

答：由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的接物镜、接目镜、镜筒长度等）进行，而且只能在这特定的情

况下重复使用，故当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。

2、在不改变目镜和物镜测微尺，而改变不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？

答：理论上是相同的。因为测量出来的值是它的实际大小，是不变的，而物境倍数的改变的同时，测微尺的目测间隔也改变，但读数不变。但是不同倍数下校正结果可能会有误差，因此结果也会有误差。

3、结合你的实验体会，总结哪些因素会造成血细胞计数板的计数误差，应如何避免？ 答：（1）造成误差的因素：技术误差（器材处理、使用不当，稀释不准确，细胞识别错误等）；固有误差（计数板、盖片、吸管等仪器不够准确与精密，细胞分布不均匀等）。 （2）避免的措施：①所用器材均应清洁干燥，计数板、血盖片、微量吸管及刻度吸管的规格应符合要求或经过校正。②细胞稀释液应新鲜、无杂质微粒。③严格操作，稀释与计数时的取样要在充分混匀后进行。④尽量扩大细胞计数范围和计数数目，一般先进行误差估计，然后决定所需计数的数目和计数范围，只要能将误差控制在允许范围内即可。

4、某单位希望检测一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1-2种可行的检测方法。

答：方法一：用待测样品与标准样品进行对比发酵试验。可以根据发酵成熟时间或者发酵产物的生成量，或者产物生成速度对比，来求得样品中的活菌的成活率。方法二：将该酵母粉进行梯度稀释与美兰染色，取样在血球计数板下进行活菌与死菌的计数，求算存活率。