细胞房工作守则新

细胞房工作守则

一、 常规

1.细胞房最多可4个人同时使用。尽量避免在内长时间逗留、交谈，最好戴口罩。

2.为保持无菌状态，经常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（1－2h）或打开空气消毒机消毒1-1.5h，人员在30-45min以后才能进入房间。每个细胞房一个组长，组长安排好该细胞房的值日表，值日生要负责当天细胞房内的所有清洁问题。组长每周安排一次彻底大扫除，包括墙面，地板，桌面，培养箱。每月过氧乙酸熏蒸（2h）的方式进行消毒。 3.细胞房实验耗材、仪器、药品等均不可随意带出。 4.培养基分瓶，各用自己的培养基，以免交叉污染。

5.血清56度，30min灭活，冷却后分装，-20度保存。要经常使用的放在4度保存。 6.新配好的培养基和血清等混合后需要试培养，即先用一瓶正常细胞培养一天以上或者不加细胞放瓶中三天以上，如未出现污染才可以拿来继续培养细胞。

7.一旦出现污染，被污染的细胞先用新洁尔灭喷一下再全部扔掉；同一批的培养基、使用的细胞清洗液等等全部重新滤过消毒；打开培养箱，用75%酒精擦洗，然后用新洁尔灭擦洗（重复2次，隔天），用紫外照射4小时以上；清扫培养室，紫外照4小时以上，重复一次。 8．清洁液的配方有三种：按重铬酸钾：浓硫酸：蒸馏水排列 强液： 63g:1000ml:200ml次强液：

120g:200ml:200ml 弱液： 100g:100ml:1000ml 最常用的是次强液。配制的时候应选用防酸、耐热、开口较大的容器盛清洁液。先将需要量的重铬酸钾和水加到容器里，最好是完全溶解。然后，缓慢、分次加入浓硫酸。配制时，注意做好自我防护。新配制的的清洁液(泡酸液)一般呈棕红色,经长时间使用后因有机溶剂和水分增多逐渐变成绿色,表明已经失效,应该重新配制.

二、 培养箱使用规则

1. 从培养箱取放物品前，用酒精清洁双手（或手套），尽量缩短开门时间和减少开门次数。 * 培养箱中的空气是经过过滤的洁净空气。长时间敞开或频繁开关培养箱，容易造成污染。 2. 培养瓶皿放入培养箱前，用酒精消毒表面，并稍等至酒精挥发后再放入，以免培养箱内滞留过多乙醇蒸气。

3. 2-3人共用一层培养箱，按预定位置摆放培养器皿，方便查找，以免长时间敞开培养箱。 4. 普通培养中的细胞，若非实验需要，每瓶/板细胞每天只需要观察生长状态一次，2人以上共用的细胞，可约好时间一起观察。

* 频繁将细胞拿出观察，容易给培养箱造成污染，同时也会影响细胞生长条件的恒定。 5. 培养箱内所接细胞须注明本人姓名（简写）且要对所接细胞负责到底，禁止丢在培养箱内不管。

三、 显微镜使用规则

1. 显微镜使用前，用酒精棉从中间至周围擦拭载物台。

2. 离开细胞房时或较长时间不需使用时，及时关上电源，延长灯泡寿命。尽量避免频繁开关显微镜电源。

四、 超净台相关操作规则

1. 超净台使用遵循预约原则。无预约者若有必要在他人预约时段内使用，需先征得预约者的同意，否则应无条件让出工作台，以免耽误他人实验。

2. 超净台使用前用紫外灯照射15-30分钟灭菌，使用前、后需用酒精棉球擦拭工作区消毒，所有物品放入超净台内使用前均应消毒。

3. 点燃酒精灯前需检查瓶中酒精是否足够，液面应占瓶高1/3-2/3。

* 消毒用75%的酒精，酒精灯用95%的酒精，向喷壶或灯内添加酒精时请留意。

* 酒精和酒精棉球由值日生负责补给，发现细胞房内存放量不足时请及时通知值日生。 4. 超净台中应摆放废液杯和废品杯各一只，用于暂时存放废弃物，实验结束后将杯内垃圾倒入水池或垃圾桶中，并冲洗晾干备用。

* 将废弃的枪头、管子内的残留液体打（倒）入废液杯后再弃入废品杯中，以免垃圾桶内留有大量培养液滋生细菌。

5. 可回收的移液管、离心管、培养瓶皿等，放入装有清水的塑料桶中浸泡，桶内需有足量的清水以没过浸泡物品。

* 可回收器皿必要时先初步涮洗后再放入桶内，尤其是培养瓶或血清管中有大量高营养的液体残留时，容易使桶内的清水长菌。

* 保证浸泡的瓶、管内完全被清水充满，而不是在装有大量空气的情况下被压倒桶底。 * 塑料桶内物品由值日生每天负责送去清洗，使用者实验结束后若发现桶已装满，请通知值日生或顺手将塑料桶带出细胞房。

6. 装培养液的瓶子、配培养液的器皿勿放入塑料桶内浸泡！应由使用者本人及时清洗晾干备用。

* 因桶内物品通常要浸泡几小时以上才送去清洗，此时细菌可能已在桶中生长并释放内毒素。细菌内毒素很难通过常规湿热灭菌步骤去除干净，即使干烤也不能保证其完全失活。内毒素对细胞生长及多种实验均有较大影响。

常用培养器皿及清洗消毒

细胞培养需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等，因此掌握清洗、消毒知识，学会清洗、消毒方法是从事细胞培养工作必须的。

一、清洗 离体条件下，有害物质直接同细胞接触，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，达到不含任何残留物的要求。

（一）玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗4个步骤。 1.浸泡:新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后用5％盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。

2.刷洗:将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干，备浸酸。 3.浸酸:浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面的可能残留物质。浸酸不应少于6h，一般过夜或更长。放取器皿要小心。 4.冲洗:刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干净，直接影响到细胞培养的成败。手工洗涤浸酸后的器皿，每件器皿至少要反复“注水－倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包装备用。 （二）橡胶制品清洗

新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15min，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15min，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20min，50℃烤干备用。 （三）塑料制品的清洗

塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。

清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗3次，双蒸

水泡24h，晾干备用。

（四）包装:对细胞培养用品进行消毒前，要进行严密包装，以便于消毒和贮存。常用的包装材料：报纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、铝箔、较大培养皿等。培养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再装入饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。

二、消毒和灭菌 微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因 （一）物理消毒法 1.紫外线消毒：离地面2m的30W灯可照射9平方米房间，每天照射2－3h，期间可间隔30min。灯管离地面2米以外要延长照射时间，2.5m照射效果较差。紫外灯照射工作台的距离不应超过1.5m，照射时间30min为宜。紫外灯不仅对皮肤、眼睛伤害，且对培养细胞与试剂等也产生不良影响，因此，不要开着紫外等操作。

2.高温湿热灭菌:压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌方法。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、物、璃器皿、属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法灭菌。

不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。从压力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液体），应立即放到60-70℃烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易为微生物污染。煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法，它具有条件简单、使用方便等特点。

3.高温干热消毒:干热灭菌主要是将电热烤箱内物品加热到160℃以上，并保持90－120min，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的。主要用于灭菌玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶）、金属器皿以及不能与蒸汽接触的物品（如粉剂、油剂）。 干热灭菌后要关掉开关并使物品逐渐冷却后在打开，切忌立即打开，以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。干烤箱内物品间要有空隙，物品不要靠近加热装置。 烧灼也是灭菌方法之一，常利用台面上的酒精灯的火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼消毒。

4.过滤除菌：是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。在体外培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。

（二）化学消毒：新洁而灭，其0.1％水溶液可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒。 （三）抗生素消毒：抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。 可用于细胞培养的消毒灭菌方法很多，但每种方法都有一定的适应范围。如常用的过滤除菌系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒实验室空气；多用新洁而灭消毒实验室地面；常用干热、湿热消毒剂浸泡、紫外照射等方法消毒培养用器皿；采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌方法消毒培养液。

补充

定期的过氧乙酸熏蒸法。ml过氧乙酸原液+等体积ml水，电炉加热熏蒸，密闭2小时以上。过氧乙酸的熏蒸效果> 气溶胶喷雾效果> 喷洒效果，在60%～80%的相对湿度下, 按1g/m3计,熏蒸2h可杀灭环境中包括芽孢在内的所有病原微生物。市场上销售的过氧乙酸原液就是指浓度为15%－20%的原液，不是100%的，用量为7ml/m3（1g/m3），按你们细胞室的立方米计算，需过氧乙酸的ml数，将过氧乙酸原液加水是为了增加空气中的湿度，杀灭病毒

效果较好。

过氧乙酸消毒液的使用方法

一、 过氧乙酸消毒液的使用 1过氧乙酸消毒液的消毒方法

（1）浸泡消毒 塑料、玻璃等耐酸用具、餐饮具、被褥、衣服等通常使用0.5%左右过氧乙酸的水溶液浸泡消毒。

（2）擦拭消毒 电器、家具等常用0.2%～0.5%过氧乙酸擦拭消毒，消毒时消毒人员应该戴乳胶手套。

（3）喷雾消毒 各种用具、运输工具和室内外的门窗、地面、墙壁等使用0.3%～0.5%的水溶液用于喷雾消毒，消毒时消毒人员应戴防护眼镜、手套、口罩，喷洒后应密闭门窗1～2小时。

⑷ 熏蒸消毒 过氧乙酸熏蒸进行室内空气消毒，杀灭细菌繁殖体的剂量为1g/m3，作用时间为120min；杀灭细菌芽胞用量3 g/m3，作用时间为90min。室内温度不低于20℃，相对湿度在60%—80%。

二、使用过氧乙酸消毒液的注意事项

1、过氧乙酸必须在通风、避光环境下低温保存，不得倒置，高温易爆。 2、过氧乙酸A、B液在使用前需混合放置24小时后，方可配制使用。

3、过氧乙酸有强烈的刺激味，对皮肤、黏膜可造成损伤，所以操作人员配药、消毒时必须做好个人防护：戴手套、目镜，穿工作服。

4、过氧乙酸对金属有腐蚀作用，消毒完毕后要用清水擦洗。 5、消毒前要关闭门窗，达到作用时间后方可开窗通风。 三、影响过氧乙酸消毒效果的因素

1、浓度和作用时间：浓度高或作用时间长，杀菌力增强；浓度减半，作用时间要增加2—5倍。

2、有机物:受有机物影响大,有机物可降低过氧乙酸的消毒作用。 3、温度:温度与杀菌作用呈正比,但-36℃仍有显著杀菌作用。 4、湿度:湿度高(20%-80%),杀菌效果好。