叶绿体色素实验

叶绿体色素的提取、分离、理化性质和含量

测定实验

一、 叶绿体色素的提取、分离

1.实验名称

叶绿体色素的提取、分离实验

2.实验原理

叶绿体中色素与内囊体膜结合成为色素蛋白复合体。这些色素不溶于水，而溶于有机溶剂，层析法原理： K=Cs/Cm。

可用乙醇等有机溶剂提取。提取液用薄层色谱法加以分离和鉴别。本实验采用酒精提取。

3.实验试剂与材料

新鲜菠菜叶

体积分数百分之九十五的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂（石油醚：丙酮：苯=7:5:1） 天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸

4.实验步骤

1．叶绿体色素的提取

（1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4~5片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉，剪碎，放入研钵中。

（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2~3ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加10ml 95%乙醇，暗处放置3~5min，上清液过滤于三角瓶中，残渣用10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。

2.色素分离：取硅胶预制板一个，用毛细管吸取提取液，在板短边据下端1厘米处划一细线，

待干后再次划线，重复3,4次。在层析缸中加入层析液，高度0.5厘米，将预制板放入层析液中进行层析。改好缸盖。待色素较好分离后，取出硅胶预制板，迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带的位置。

5.实验结果与分析

滤纸条上出现4条色素带，从上到下依次是： 橙黄色 胡萝卜素（最快） 黄色 叶黄素

蓝绿色 叶绿素a（最多）

黄绿色 叶绿素b（最慢） Rf： 胡萝卜素 7.1/7.6≈0.93 叶黄素 6.2/7.6≈0.82 叶绿素a 6.5/7.6≈0.86 叶绿素b 6.3/7.6≈0.83

二.理化性质

1.实验目的

验证叶绿素的理化性质。

2.实验原理

叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。

3.实验试剂与材料

新鲜菠菜叶

刻度试管，小试管，试管架，水浴锅，10毫升移液管

体积分数百分之九十五的乙醇，苯，醋酸铜粉末，质量分数百分之五的稀盐酸，醋酸-醋酸铜溶液，氢氧化钾-甲醇溶液。

4.实验步骤

1.光对叶绿素的破坏

取2支小试管，各加2.5毫升叶绿体色素提取液，用乙醇稀释一倍。一支放光下，一支放暗处用锡箔纸包严，40分钟后对比颜色变化。

取分离成的硅胶色谱板一个，一半用黑纸包住放在阳光下，半小时后比较各色素颜色变化。 2.皂化作用（绿色素与黄色素的分离）

取一支10毫升刻度试管加入3毫升叶绿体色素乙醇提取液，加入1ml 20%KOH-甲醇溶液，充分摇匀。

片刻后，加入3ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1ml蒸馏水，轻轻混匀（勿激烈摇荡），于试管架上静置分层。滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时，静置。可以看到溶液逐渐分为两层，下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和b（以及少量的叶黄素）；上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。 3.H+和Cu++对叶绿素分子中Mg++的取代作用

取上述色素乙醇提取液5毫升于两支试管中，一支加入5%HCl数滴，摇匀，直至溶液出现褐绿色，当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，60度水浴加热，观察记载溶液颜色变化情况另一支对照。

取新鲜植物叶片两片，放入试管中，加醋酸-醋酸铜溶液，使之没过叶片，90度水浴加热，直至叶片颜色不再变化。

4.荧光现象的观察

取1支刻度试管加入3ml叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同。

5.实验结果与分析

1在光下的叶绿素层明显变暗，说明叶绿素在光下会被破坏

2 皂化反应后溶液分为3层，上层黄色，中间绿色，下层白色混浊。说明绿色素会被皂化，溶于乙醇溶液中，而黄色素不会被皂化，溶于苯溶液中。

3 H+ 和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代反应使溶液先变褐色，加热后变深绿。说明H+会取代mg2+，而Cu2+则会取代H+和mg2+造成颜色变化。 4．在光的直射下，叶绿体色素提取液呈深褐色。反射下，呈红色。说明不同的叶绿体色素，从稳态到激发态所需的能量不同，在不同的光照强度下，不同的色素站主导位置，导致最终的颜色不同。

实验讨论

本次实验，过程很繁琐，注意事项也比价多，好在这个实验我们高中便接触过，我们也很耐心的，一步一步做，最后做的比较成功。但经过此次实验，我们对叶绿素有了很多的了解。特别是它的理化性质。总之，亲身探索科学是有趣的，远比理论学习强。我认为，我们以后应该更注重实际操作，多动手，只有亲自探索实验了，才有更深的体会，更大的收获！