叶绿体色素的提取 - 图文

叶绿体色素的提取、分离、定量及理化性质的鉴定

【实验目的】

1.掌握提取和分离叶绿体色素的方法； 2.掌握测定叶绿体色素含量的方法；

3.熟悉叶绿体色素的理化性质及吸光特性；

4.了解植物叶绿体色素组成及其与生境的相关性。 【实验原理】

1.叶绿体色素是植物进行光合作用的重要物质，叶绿体色素包含绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类，这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色层分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。

2.叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开

图一：叶绿素的结构

3.叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。

图二：叶绿素对光能的吸收与能量转变示意图

4.叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素。

铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。

5.叶绿体色素具有吸光特性，可利用分光光度计在某一特定波长下测定色素溶液光密度，即可用公式计算出其中各色素的含量。 各种色素含量计算如下：

Chla（μg /ml）=12.7 OD663－2.69OD645 Chlb（μg /ml）=22.9 OD645－4.68 OD663 ChlT（μg /ml）=Chla + Chlb

0.1ml提取液Chla含量（μg ）=Chla（μg /ml） *0.1ml*稀释倍数 0.1ml提取液Chlb含量（μg）=Chlb（μg /ml） *0.1ml*稀释倍数 0.1ml提取液ChlT含量（μg ）=ChlT（μg /ml） *0.1ml*稀释倍数 （ 菠菜：稀释倍数=0.1ml/3ml=30，玉米：稀释倍数=0.3ml/3ml=10） 每种叶绿素含量计算（以Chla为例）：

Chla含量（μg /g）?1ml提取液Chla含量（μg ） ?V总

FW其中FW为样品总重（2.0g菠菜叶片，0.2g玉米叶片），V总=10ml

6.叶绿体色素易受光氧化，提取色素应在弱光中进行，并避光保存色素。光照下叶绿体色素会被破坏。 【实验材料】

1.材料：菠菜叶片，玉米叶片 2.试剂：9丙酮（100%及80%）；石英砂；碳酸钙粉；四氯化碳；醋酸铜； HCl（6N）乙醚，KOH-甲醇

3.器材：研钵，培养皿，量筒，试管，滴管，定性滤纸，分光光度计，比色皿 【实验内容】

1.叶绿素的提取与定量

（1）取菠菜新鲜叶片2g，玉米新鲜叶片0.2g。洗净，擦干，去掉中脉（玉米叶片可直接剪碎），剪碎，放入研钵中。

（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，取10ml丙酮，分几次加入研钵，充分研磨后过滤，定容至10,mL。

（3）将两种植物的叶绿素提取液置于试管中，避光保存。备用。

（4）取0.1 ml菠菜叶片色素提取液及0.3ml玉米叶片色素提取液，用丙酮稀释到3 ml ，

测定吸收光谱（400nm-700nm），测定663、645 nm 处的吸光值，根据公式计算叶绿素a、叶绿素b的含量。

2.叶绿体色素的分离：

取圆形定性滤纸一张，用毛细管吸取叶绿体色素提取滴在圆形滤纸中心，使色素扩散的宽度限制在0.5 cm以内，保证叶绿素扩展速度均匀,保证色素扩展清晰,风干后，应多点样几次,大约20次左右.

在圆形滤纸中心戳一圆形小孔（直径约3mm），将纸捻一端插入圆形滤纸的小孔中，使与滤纸刚刚平齐（勿突出）。

长形滤纸一条，也点样后层析分离（用于测定吸收光谱）

培养皿中加入适量的四氯化碳，把带有纸捻的圆形滤纸平放在培养皿上，使纸捻下端浸入推动剂中。迅速盖好培养皿。此时，推动剂借毛细管引力顺纸捻扩散至圆形滤纸上，并把叶绿体色素向四周推动，不久即可看到各种色素的同心圆环。所用培养皿底、盖直径应相同，且应略小于滤纸直径，以便将滤纸架在培养皿边缘上。

长形滤纸放入盛有四氯化碳大试管中，进行层析后获得线形不同色素条带，分别剪下后测定吸收光谱。

叶绿素的理化性质部分 3荧光现象的观察

用反射光和透射光观察提取液的颜色有何不同，反射光下观察到的提取液颜色即为叶绿素产生的荧光颜色。

4光对叶绿素的破坏作用：

取叶绿体色素提取液少许，分装两支试管中，一支放在黑暗处（或用黑纸套包裹），另一支放在强光下（阳光下），经过2-3h后，观察两支试管中溶液的颜色有何不同。 5.铜代反应：

取色素提取液少许于试管中，一滴一滴加浓盐酸，直至溶液颜色出现褐绿色，此时叶绿素分子已遭破坏，形成去镁叶绿素。然后加醋酸铜晶体少许，慢慢加热溶液，则又产生鲜亮的绿色。此即形成了铜代叶绿素。 6.皂化反应：

取叶绿体色素提取液2 mL于大试管中，加入4mL乙醚，摇匀，再沿试管壁慢慢加人3mL蒸馏水，轻轻混匀，静置片刻，溶液即分为两层，色素已全部转入上层乙醚中。

用滴管吸取上层绿色层溶液，放入另一试管中。加入30％KOH－甲醇溶液，充分摇匀，再加入蒸馏水约3-5 mL，摇匀静置。可以看到溶液逐渐分为两层上层是黄色素，下层是绿色素。

【实验结果】

1.各吸收光谱的测定

波长（nm） 400 410 420 430

总光和色素

第一次

第二次

第三次

平均

色素1 0.040 0.043 0.047 0.0

色素2 0.053 0.063 0.066 0.0

色素3 0.534 0.644 0.667 0.7

色素4 0.224 0.023 0.331 0.4

0.464 0.566 0.633 0.70.406 0.496 0.560 0.60.471 0.562 0.627 0.70.447 0.541 0.607 0.7

49 440 0.718 450 0.503 460 0.493 470 0.448 480 0.322 490 0.172 500 0.082 510 0.041 520 0.027 530 0.024 540 0.028 550 0.027 560 0.030 570 0.046 580 0.056 590 0.054 600 0.062 610 0.081 620 0.091 630 0.081 640 0.111 650

0.124 35 0.60.748 06 0.40.546 09 0.40.437 99 0.30.495 58 0.20.380 38 0.10.245 00 0.00.165 16 0.00.026 76 0.00.015 63 0.00.010 58 0.00.015 63 0.00.015 62 0.00.017 64 0.00.031 78 0.00.040 85 0.00.040 85 0.00.048 98 0.00.166 13 0.00.177 24 0.00.170 17 0.00.198 47 0.10.203 49 0.60.091 50 0.40.086 53 0.40.076 40 0.40.034 40 0.30.013 38 0.10.072 25 0.00.088 14 0.00.048 08 0.00.035 05 0.00.031 03 0.00.035 03 0.00.035 03 0.00.037 02 0.00.052 03 0.00.060 08 0.00.060 03 0.00.069 03 0.00.087 01 0.00.097 03 0.00.089 02 0.10.019 05 0.10.068 96 0.00.578 41 0.00.266 93 0.00.251 24 0.00.267 30 0.00.145 64 0.00.017 91 0.00.007 57 0.00.005 45 0.00.004 47 0.00.002 50 0.00.002 52 0.00.003 53 0.00.003 63 0.00.004 84 0.00.111 01 0.00.005 96 0.00.105 10 0.00.105 40 0.00.105 51 0.00.106 32 0.00.109 38 0.00.221 0.427 0.496 0.543 0.389 0.192 0.084 0.063 0.031 0.035 0.035 0.039 0.042 0.045 0.050 0.056 0.063 0.069 0.069 0.070 0.083 0.159 0.2