2019年
特训13 基因工程的应用
1．(2018·广东四校联考)如图所示的质粒中，Tet为四环素抗性基因，LacZ′基因的表达产物能使白色的大肠杆菌菌落变成蓝色。现用EcoRⅠ切割目的基因及质粒载体并进行连接，将得到的重组质粒转化大肠杆菌，以对目的基因进行保存和扩增。请回答下列问题：
r
(1)将目的基因和质粒载体连接需使用的工具酶是________________。为将载体导入大肠杆菌，常用Ca处理使之处于________________。
(2)LacZ′基因在基因工程中起__________基因的作用。为筛选导入重组质粒的大肠杆菌，应在培养基中加入________，筛选________(填“蓝色”或“白色”)菌落。
(3)若需要将这个质粒改造成基因工程表达载体，还需要插入________和________部分。将改造后的表达载体和目的基因经EcoRⅠ酶切连接，并成功导入受体细胞后，发现仍有部分细胞不能表达出目的蛋白，最可能的原因是____________________________________。
为了避免上述情况发生，最好用________________切割目的基因和表达载体。
(4)我国对农业转基因生物实施标识制度，比如由转基因大豆加工制成的大豆油，标注为“本产品加工原料中含有转基因大豆，但本产品已不再含有转基因成分”，其相关的生物学依据是________________________________________________________________________。
答案 (1)DNA连接酶 感受态 (2)标记 四环素 白色 (3)启动子 终止子 目的基因与质粒载体反向连接 两种限制酶 (4)大豆油属于脂肪，不含目的基因编码的蛋白质
解析 (1)将目的基因和质粒载体连接需要使用的工具酶是DNA连接酶；为将载体导入大肠杆菌，常用Ca处理使之处于感受态。(2)LacZ′基因在基因工程中起标记基因的作用；为筛选导入重组质粒的大肠杆菌，应在培养基中加入四环素；由于构建重组表达载体过程中LacZ′基因已经被破坏，因此应该筛选白色菌落。(3)基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、标记基因、终止子、复制原点等；将改造后的表达载体和目的基因经EcoR Ⅰ酶切连接，并成功导入受体细胞后，发现仍有部分细胞不能表达出目的蛋白，最可能的原因是目的基因与质粒载体反向连接，为了避免上述情况发生，最好用两种限制酶切割目的基因和表达载体。(4)我国对农业转基因生物实施标识制度，比如由转基因大豆加工制成的大豆油，标注为“本产品加工原料中含有转基因大豆，但本产品已不再含有转基因成分”，其相关的生物学依据是大豆油属于脂肪，不含目的基因编码的蛋白质。
2．(2018·东北五校联考)透明质酸酶临床常用作药物渗透剂，目前市场上出售的透明质酸酶主要从动物组织中提取，成本高且提纯困难，科研人员尝试将透明质酸酶基因转入大肠杆菌，使其高效表达。部分过程如图所示，请回答下列问题：
2＋2＋
2019年
(1)步骤①代表的是基因工程操作程序中的________________________，由图可知，此步骤中，选择用限制酶______________去切割DNA分子中的____________键。
(2)基因工程一般选择大肠杆菌作为受体，这是因为大肠杆菌具有________________________________________________________________________的特点。
(3)透明质酸酶基因进入大肠杆菌，并且____________________的过程，称为转化。转化时，首先需要用________处理大肠杆菌，使其处于感受态。
(4)透明质酸酶基因导入受体细胞后，需通过_______________技术检测其是否成功转录。
答案 (1)基因表达载体的构建 NcoⅠ和XhoⅠ 磷酸二酯 (2)繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少 (3)维持稳定和表达 Ca (4)RNA－DNA分子杂交
解析 (1)步骤①代表将目的基因即透明质酸酶基因和作为载体的质粒连接，完成基因表达载体的构建；据图可知，要用限制酶Nco Ⅰ和Xho Ⅰ去切割DNA，断开磷酸二酯键，便于目的基因和质粒连接。(2)基因工程中一般选择大肠杆菌作为载体的原因是大肠杆菌属于单细胞生物，繁殖速度快，容易培养，遗传物质相对较少，容易对遗传物质进行改造。(3)透明质酸酶基因导入大肠杆菌，并且能维持稳定，在大肠杆菌细胞内能表达，控制合成透明质酸酶，这个过程称作转化；转化时，需要用Ca(氯化钙)处理大肠杆菌，使其处于感受态，即能吸收周围环境中DNA分子的状态。(4)透明质酸酶基因导入大肠杆菌后，需要通过RNA－DNA分子杂交技术来检测目的基因是否转录出了mRNA。
3．(2018·广州毕业班测试)现有重组质粒甲(共含2 686 个碱基对，不含T－DNA)和乙，为避免基因反接，研究人员用限制酶Ⅰ和Ⅱ切割重组质粒甲、乙，再利用所得片段构建了重组质粒丙(如图所示)，然后采用农杆菌转化法将丙导入胡萝卜愈伤组织细胞。培养后得到转VP1基因胡萝卜植株。请回答下列问题：
2＋
2＋
(1)构建重组质粒丙的目的是_________________________________________
2019年
________________________________________________________________________， 利用重组质粒甲、乙构建丙的过程中，用到的工具酶是________________________。
(2)实验过程中，将愈伤组织浸入农杆菌(含重组质粒丙)培养液中一段时间，其目的是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。
(3)将重组质粒甲、乙和丙进行分组，每组中含其中一种重组质粒，同时用限制酶Ⅰ和Ⅱ切割，结果如下表所示：
组别 第1组 第2组 第3组
切割前，重组质粒甲含有________个游离的磷酸基团，限制酶Ⅰ在重组质粒甲中有________个切割位点，表中第________组是切割重组质粒丙的结果。
(4)在植物组织培养过程中需要无菌操作，因此对外植体(离体的组织块)要进行________处理。用于培养外植体的培养基不适用于培养胚状体，原因是_______________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)将VP1基因插入到T－DNA中，从而使VP1基因进入植物细胞后，能整合到染色体的DNA上 限制酶Ⅰ、Ⅱ和DNA连接酶 (2)利用农杆菌感染植物，将VP1基因转移到受体细胞中 (3)0 1 2 (4)消毒 培养基中添加的植物激素(植物生长调节剂)的种类和含量比例有所不同
解析 (1)由图可知，重组质粒甲中含有目的基因，不含T－DNA，而重组质粒乙中含有T－DNA，不含目的基因，所以构建重组质粒丙的目的是将VP1基因插入到T－DNA中，从而使VP1基因进入植物细胞后，能整合到染色体的DNA上；在构建重组质粒时，用到的工具酶是限制酶Ⅰ、Ⅱ和DNA连接酶。(2)将愈伤组织浸入含重组质粒丙的农杆菌培养液中，其目的是利用农杆菌感染植物，将VP1基因转移到受体细胞中。(3)因为质粒是小型环状的DNA分子，环状DNA分子没有游离的磷酸基团；由表中数据可知，第1组经切割后产生含有2 146和540个碱基对的2种DNA片段，两个片段之和为2 686个碱基对，所以第1组为重组质粒甲，重组质粒甲中有2个限制酶切割位点，其中限制酶Ⅰ在重组质粒甲中只有一个切割位点；第2组中含有重组质粒甲中的540个碱基对片段，所以第2组为切割重组质粒丙的结果。第3组为切割重组质粒乙的结果，重组质粒丙中含有重组质粒甲中的540个碱基对片段和重组质粒乙中的12 400个碱基对片段。(4)为了防止杂菌感染，植物组织培养过程中需要对外植体进行消毒处理，处理方法一般用酒精、无菌水和次氯酸钠清洗；培养外植体是使其发生脱分化形成愈伤组织，培养胚状体是使其发芽和生根，所以培养基中添加的植物激素(植物生长调节剂)的种类和含量比例有所不同。 4．(2018·湖北八校联考)北极比目鱼中有抗冻基因，如图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图。请回答下列问题：
切割后所得DNA片段的情况 只得到含有2 146和540个碱基对的2种DNA片段 只得到含有540和12 400个碱基对的2种DNA片段 只得到含有12 400和1 000个碱基对的2种DNA片段
2019年
(1)利用过程①的方法构建的基因文库是________(填“基因组文库”或“部分基因文库”)。
(2)过程②中常需要使用限制酶和DNA连接酶，既能连接黏性末端又能连接平末端的DNA连接酶是________________。
(3)为使过程①获取的目的基因在番茄细胞中能够表达，在构建表达载体时，需在目的基因的两端加入________________。
(4)将重组质粒导入农杆菌，并通过农杆菌的转化作用，可以将目的基因导入番茄体细胞中染色体的DNA上，其原理是_______________________________________________
________________________________________________________________________。
(5)要确认抗冻基因是否在转基因番茄植株中正确表达，应检测转基因番茄植株中该基因的____________是否呈阳性。
答案 (1)部分基因文库 (2)T4DNA连接酶 (3)启动子、终止子 (4)目的基因随农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA 转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上 (5)表达产物
解析 (1)用某种生物发育的某个时期的mRNA逆转录产生的多种互补DNA片段属于部分基因文库。(2)既能连接黏性末端又能连接平末端的DNA连接酶是T4DNA连接酶。(3)在构建表达载体时，需在目的基因的两端加入启动子和终止子。(4)将重组质粒导入农杆菌，通过农杆菌的转化作用，可以将目的基因导入番茄体细胞中染色体的DNA上，其原理是农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA 可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。(5)检测目的基因是否表达，可从转基因生物中提取基因的表达产物即蛋白质(抗冻蛋白)，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若呈阳性，表明目的基因已成功表达。
5．(2018·石家庄毕业班质检)资料一：PCR(聚合酶链式反应)三个基本反应步骤是模板DNA在体外加热至95 ℃时解旋成单链，温度降至55 ℃左右，引物与模板单链按碱基互补配对的原则结合，再调至72 ℃左右时，DNA聚合酶沿5′→3′(磷酸到五碳糖)的方向延伸引物合成互补链。三个步骤完成一次称为一个循环。
资料二：图1显示了目的基因及其上限制酶切点，A、B、C、D是四种单链DNA片段；图2是质粒(显示限制酶切点和标记基因)，一般来说，为了使切割后的目的基因与运载体结合，往往使用两种限制酶，同时还要破坏载体上的一个标记基因。根据资料回答下列问题：
(1)若利用PCR技术增加目的基因的数量，所用的酶是____________。由图1可知，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取________作为引物，该DNA分子在PCR仪中经过4次循环后会产生DNA片段________个。
(2)为了提高目的基因和质粒的重组成功率，同时有利于受体细胞的筛选，应该选择的限制酶是______________。
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