（四）多序列分析及系统进化树构建
实验目的：掌握多序列比对、构建系统进化树的基本步骤，熟悉使用CLUSTALW、MEGA5.1等软件的使用。 实验内容：
1、利用CLUSTALW工具进行多序列比对，学会参数设置，结果输出。将
本实验室获得的仿刺参EGFR基因氨基酸序列，搜索同源序列，保存序列进行
比对。
2、利用MEGA5.1构建系统进化树，并用自展分析对进化树进行评估。 实验步骤：
1、将仿刺参EGFR基因氨基酸序列使用在线NCBI工具，进行Blast同源性比较见表1。
NCBI上做Blast
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi 找到相似度最高的几个序列，通常把序列（Fasta格式文件）下载下来，或点击GenBank登录号，复制FSATA格式，整合在一个*.txt文档中（单独建立一个文件夹存放，后面的很多文件会自动装入该文件夹），如
>XXXX
AGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAGCGAGGGTGCTTGCACCTTAGCTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGAATGCTAATACCGCATACGCC
表1氨基酸序列的同源性比对
物种 （Species） Anopheles gambiae Nasonia vitripennis Xiphophorus xiphidium Camponotus floridanus
Danio rerio Drosophila melanogaster Gryllus bimacμlatus Xenopus (Silurana)
tropicalis Lymnaea stagnalis
ABQ10634
46%
GenBank 登录号 (GenBank Accession No.)
CAC35008.1 XP_001602830 AAP55673 EFN60989 NP_919405 AAR85245 BAG65666 XP_002939960
相似性 (Similarity) 47% 49% 46% 49% 47% 49% 48% 47%
Gallus gallus Rattus norvegicus
NP_990828 EDL97896.1
47% 47%
2、仿刺参EGFR氨基酸序列通过GENBANK数据库比较，经CLUSTAL W
多重序列比对分析（图1）（注：图为部分比对序列图）。 3、
应用MEGA5.1软件在Bootstrap置信值为1000的条件下构建同源关系树 (图2)。在同源关系树中，直观的显示了仿刺参EGFR基因与其他各物种之间的相互关系。由同源树可已看出，仿刺参EGFR序列自聚为一支，在分子进化地位上与其生物学分类一致，因而得到的关系树反映了上述物种进化关系的远近。
图1 仿刺参与其他物种的EGFR氨基酸序列比较
注：“*”表示相同氨基酸，“：”“·”表示相似氨基酸，“-”表示此位置缺失氨基酸
100 97 100 89 99
Camponotus floridanus Nasonia vitripennis Gryllus bimaculatus
Drosophila melanogaster Anopheles gambiae
Lymnaea stagnalis
100
Xiphophorus xiphidium Danio rerio
100
99
100
Xenopus tropicalis Rattus norvegicus Gallus gallus
Apostichopus japonicus
0.1
A
图2 根据EGFR氨基酸序列构建的系统进化树
注：用MEGA5.1软件Njboostrap方法构建，分支上的数字代表boostrap值
具体操作步骤如下：
点击File/load sequences，将整理好的*.txt序列文件导入clustalx1.83，如图
接着点击Alignment/Do Complete Aligment
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