热点实验：明胶酶谱MMP活性检测实验案例介绍 - 图文

大鼠心脏组织明胶酶谱MMP活性检测实验

实验仪器 泳电源Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)；电泳仪及附件Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)

实验标本 大鼠心脏组织20个

实验试剂

1、凝胶试剂：30%丙烯酰胺溶液；Tris-Base（SIGMA）；10%SDS（SIGMA）；10%过硫酸铵；TEMED（sigma）

2、常用溶液及缓冲液：制备含MMP底物蛋白SDS-PAGE凝胶：采用8%分离胶。将20Xsubstrater融化，并90℃加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中加入20Xsubstrate并使之稀释20倍，混匀，然后再加入过硫酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。 A．5%积层胶所用溶液 按总体积2.5ml：

ddH2O： 1.575ml 30%丙烯酰胺溶液： 0.42ml 1.0mol/L Tris (PH=6.8)： 0.315ml 10%SDS： 25ul 20Xsubstrate： 125ul 10%过硫酸铵： 25ul TEMED： 3ul B．8%分离胶溶液 按总体积10ml：

ddH2O： 4.1ml 30%丙烯酰胺溶液： 2.7ml 1.0mol/L Tris (PH=8.8)： 2.5ml 10%SDS： 100ul 20Xsubstrate： 500ul 10%过硫酸铵： 100ul TEMED： 6ul C．电泳缓冲液，1L

3g Tris-Base、14.4g 甘氨酸、1g SDS，加蒸馏水至IL，pH应该在8.3左右。也可以制成10×的储存液，在室温下长期保存。

检测步骤

A、 阳性对照及待检测样品的前处理及上样 阳性对照：取5ul positive mixture与2XSDS-PAGE non-reducing buffer 等体积混合。待测样品5ul则1：1稀释于2XSDS-PAGE non-reducing buffer，混合后直接上样。不加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。每孔点样10ul。 B、电泳 30mA恒流电泳45min，溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。

C、洗涤凝胶 驱除凝胶，去除压缩胶。放入容器中，先用适量蒸馏水冲洗凝胶。然后加入10ml

1Xbuffer A，室温漂洗凝胶2X15分钟。中间换液2次。

D、孵育 倒掉Buffer A。加入10ml 1Xbuffer B，室温孵育4小时。

E、显色 倒掉Buffer。加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液水平摇床上染色120min后，再采用脱色液（甲醇浓度为25% ,乙酸浓度为10 %）进行脱色60min。

F、条带扫描 将凝胶放在扫描仪上扫描。用非透射光扫描，显示调整为灰度。并分析IOD值。72 kDa为MMP-2，92 kDa为MMP-9。 试剂盒组成与储存

1. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, ?20 ℃ 2. MMP-2 and MMP-9 positive mixture 500 μl, ?20℃ 3. 10 × Substrate G, 50 ml, ?20℃ 4. 10 × Buffer A, 50 ml, 4℃ 5. 10 × Buffer B, 50 ml, 4℃ 6. 10 × Mem-Gel Stain, 50 ml, 4℃

实验结果

注：阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD（integrated optical density）累积光密度参考值。(例如：1.33E+05=1.33×105)。 P: positive mixture 每孔点样蛋白约10ug

Lanes: Lane1 Rows MMP-9 MMP-2 样本

(IOD) 16200 12535 1

Lane2 (IOD) 20200 101884 2

Lane3 (IOD) 26700 3

Lane4 (IOD) 33200 4

Lane5 (IOD)

Lane6 Lane7 (IOD) (IOD)

Lane8 (IOD)

Lane9 (IOD)

LaneP (IOD) 60323 16578 P

30474 43300 38600 5

6

7

35131 23500 8

9

12974 12322.6 12170.2 11685 12481 9677.5 12522

Lanes: Lane 1 Lane 2 Lane 3 Lane 4 Lane 5 Lane 6 Lane 7 Lane 8 Lane 9 Lane P Rows MMP-9 MMP-2 样本

(IOD) 25390 10120 10

(IOD) 25500 12053 11

(IOD) 44900 13797 12

(IOD) 42000 15995 13

(IOD) 60300 15138 14

(IOD) 43400 13139 15

(IOD) 43100 15800 16

(IOD) 36600 12447 17

(IOD) 33400 12514 18

(IOD) 67703 14632 P

Lanes: Lane 1 Lane 2 Lane P Rows MMP-9

(IOD) 29000

(IOD) 66424

(IOD) 66935

MMP-2 样本

3164.7 9350.6 19

20

13975 P

实验咨询：service@jiamay.com

嘉美生物是一家主要从事Annexin V,信号转导抗体,重组人和动物蛋白,磷酸化抗体,各种动物ELISA试剂盒,生物实验服务等研发与销售的高科技生物公司。

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