逆境胁迫

1 / 11 逆境胁迫对植物生理生化代谢的影响 20093391 魏晓明 农学0901

摘要：对植物产生伤害的环境称为逆境，又称胁迫。常见的逆境有 寒冷、干旱、高温、盐渍等。逆境会伤害植物，严重时会导致植物死亡。逆境对植物的伤害主要表现在细胞脱水、膜系统受破坏，酶活性受影响，从而导致细胞代谢紊乱。有些植物在长期的适应过程中形成了各种各样抵抗或适应逆境的本领，在生理上，以形成胁迫蛋白、增加渗透调节物质（如脯氨酸含量）、提高保护酶活性等方式提高细胞对各种逆境的抵抗能力。

关键词：逆境胁迫,抗逆性，相对电导率，脯氨酸，丙二醛，样品，细胞膜透性，过氧化物酶活性，叶绿素，可溶性糖。

前言：植物细胞膜起调节控制细胞内外物质交换的作用，它的选择透性是其最重要的功能之一。当植物遭受逆境伤害时，细胞膜受到不同程度的破坏，膜的透性增加，选择透性丧失，细胞内部分电解质外渗。膜结构破坏的程度与逆境的强度、持续的时间、作物品种的抗性等因素有关。因此，质膜透性的测定常可作为逆境伤害的一个生理指标，广泛应用在植物抗性生理研究中。 当质膜的选择透性被破坏时细胞内电解质外渗，其中包括盐类、有机酸等，这些物质进入环境介质中，如果环境介质是蒸馏水，那么这些物质的外渗会使蒸馏水的导电性增加，表现在电导率的增加上。植物受伤害愈严重，外渗的物质越多，介质导电性也就越强，测得的电导率就越高（不同抗性品种就会显示出抗性上的差异）。

在植物胁迫处理过程中，叶绿素含量会下降，可以把叶绿素含量下降看作是胁迫发展中由功能性影响到器质性伤害的一个中间过程。

过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，他与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，他的活性不断变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。

植物体内的碳素营养状况以及农产品的品质性状，常以糖含量作为重要指标。植物为了适应逆境条件，如干旱、低温，也会主动积累一些可溶性糖，降低渗透势和冰点，以适应外界环境条件的变化。

植物器官衰老时，或在逆境条件下，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（MDA）是其产物之一，通常利用它作为脂质过氧化指标，表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。 植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要作用。在正常情况下，细胞膜对物质具有选择透性能力。当植物受到逆境影响时，如高温、干旱、盐渍、病原菌侵染后，细胞膜遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，以至于植物细胞侵提液的电导率增大。膜透性增大的程度与逆境胁迫强度有关，也与植物抗逆性的强弱有关。 1 材料与方法

1.1供试材料 取生长状况相同的健康八角金盘叶片，随机取若干叶片置于冰箱中低温胁迫处理一段时间，另一组置于常温阴凉的室内，待低温胁迫处理完毕，将两组叶片分别取出，作为实验材料。

1.2实验设计与方法 将经过低温胁迫处理过的叶片标记为样品A，未经处理的叶片为样品B

（1） 叶绿体含量的测定。 ① 分别取样品A与样品B叶片的剪碎样品（去掉叶中脉）各0.18g. ② 将样品分别放入研钵中，加入少量石英砂和碳酸钙及95%的乙醇2～3ml，待研磨成匀浆，将提取液过滤至25ml棕色容量瓶中，用少量95%乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 ③ 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中，直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。 ④ 把叶绿体色素提取液A和B分别离心3分钟后，分别倒入光径1cm的比色皿内。以95%乙醇为空白，在波长652nm下测定吸光度。

⑵ 相对电导率的测定。 ① 用相同的打孔器分别在样品A和样品B上各取30个小圆片，在打孔过程中应尽量避开叶脉。 ② 将样品A的30个小圆片置于大试管1中，将样品B的30个小圆片置于大试管2中，分别向两试管各加入15ml的蒸馏水。 ③ 将试管1和2置于37℃的恒温振荡锅中振荡40分钟后冷至室温后在电导仪下测电导率。 ④ 测过电导率之后，再将两试管放入100℃沸水浴15分钟，以杀死植物组织，取出后用自来水冷却10分钟，在室温下测其煮沸电导率。

⑶过氧化物酶活性的测定。 ① 分别取1.0g样品A和B,将其剪碎研磨至匀浆，分别过滤至两个50ml的容量瓶中，用蒸馏水定容，分别全部装入离心管中，在每分钟4000转的条件下离心3分钟。 ②各取0.1ml的离心提取液（上层清液），分别加入0.05mol/L磷酸缓冲液2.9ml,2%H2O2 1.0ml,0.05mol/L愈创木酚1.0ml。 ③将上述溶液分别置于比色皿中，在470nm的波长下测定 吸光度，每隔1分钟测一次，每种样品测三次吸光度。 ⑷丙二醛含量的测定。 ①分别取1.66g样品A和样品B，再分别加入少量10%三 氯乙酸（TCA）,研磨充分后再用刻度管加TCA至溶液10ml, 将溶液在每分钟4000转条件下离心3分钟。 ②各取2ml离心上层液，分别再加入硫代巴比妥酸（TBA） 2ml，充分混合后分别置于沸水浴中15分钟，冷却后再离心一次。 ③分别测定②中上清液在532nm,600nm处的吸光度值，并 以2ml的TCA作比色的空白对照，根据公式，算出MDA浓度。

⑸可溶性糖含量的变化。 ①分别取1.0g的剪碎A样品和B样品，置于两试管中，各加入10ml蒸馏水，放在沸水浴中15分钟。 ②将上述溶液过滤，用蒸馏水反复漂洗试管及残渣并定容至50ml。 ③各取②中相应提取液0.1ml，再分别加入5ml蒽酮试剂，置于沸水浴中1分钟，冷却后在620nm的波长下分别测其吸光度，以蒽酮试剂作比色皿的空白对照。

2 结果与分析。 2.1数据记录和处理 实验一

样品 652nm下的吸光度 色素浓度（mg/l） 色素总量(mg/g 样品A 0.423 12.261 1.703 样品B 0.291 8.435 1.171 其中一次吸光度A652，色素浓度CT, CT= A652X1000/34.5

色素总量=色素浓度x提取总量/样品重 实验二

样品 电导率(us/cm) 煮沸电导率 伤害率 (%) 样品A 261 701 37.2 样品B 58 701 8.3 其中 相对电导率=处理电导率/煮沸电导率

用相对电导率来反映植物的伤害率，室温下纯水的电导率为0.084， 实验三

样品 第1次 第2次 第3次 过氧化物酶活性 样品A 0.170 0.180 0.185 0.0015 样品B 0.310 0.370 0.410 0.0100 以每分钟A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（U）。 过氧化物酶活性{U/(g.min)}=△A470xVT/WxVSx0.01xt 式中：△A470为反应时间内吸光度的变化；W为叶片鲜质量(g);t为反应时间(min);VT为提取酶液总体积(ml);VS为测定时取用酶液体积(ml)。

实验四

样品 532nm吸光度 600nm吸光度 MDA含量（u mol/g） 样品A 0.151 0.037 4.43x10-9 样品B 0.279 0.101 6.92x10-9

其中A532-A600=155000XCXL 算出MDA浓度（u mol/L），进一步算出单位质量组织中MDA含量（u mol/g）。式中A532和A600分别表示532nm和600nm波长处的吸光度值。L为比色杯厚度（cm）,一般为1cm。 实验五

在620nm的波长下，样品A的吸光度为0.428，样品B的吸光度为0.958， 2.2 实验结果分析 画图可知

注：图表中相应数据做了一定倍数的扩大，以便于绘制图表，反映出不同样品间各物质的差异，从而了解植物在低温胁迫下生理生化代谢的变化。（其中色素总量x10-1(mg/g);伤害率为图表中的实际数据，无单位；酶活性x10-3{U/(g.min)};MDA含量x10-9(umol/g)）; 从实验五数据可知，低温胁迫处理的叶片吸光度低，说明细胞内积累的可溶性糖较多，致使吸光度降低。

从图表中可以看出，经过胁迫处理的叶片细胞通透性增加，色素及电解质分子外流，使色素加速流出，电解质流出，使电导率增大，代谢活动受到抑制，过氧化物酶活性降低，膜脂过氧化作用减少，丙二醛MAD含量减少，细胞开始积累可溶性糖。

3 小结与讨论 从实验中我们可以看到在低温胁迫处理下，引起的一系列生理生化指标的差异性变化，相比于未作处理的样品B,经过低温胁迫处理的样品A色素浓度明显增大，电导率大，过氧化物酶的活性较低，MDA含量减少。 通过实验，我们看到，经过低温胁迫处理的八角金盘叶片细胞膜的透性增大，使大量色素和电解质流出细胞外，实验中色素浓度和电导率都比未经处理的叶片明显较大，这是细胞透性增大的依据，从实验三中，我们可以看到，样品A的过氧化物酶活性为0.0015，样品B的过氧化物酶活性为0.0100，样品A的过氧化物酶活性明显降低，说明此时植物体内代谢变慢，在此，我们不能排除低温对酶活性的暂时钝化。 从实验二可以看到，样品A的伤害率 (%)为37.2，样品B的伤害率 (%)为8.3，排除实验操作过程中的机械损伤，样品A的实际伤害率 (%)为28.9(计算方式为37.2-8.3)，实验说明，低温不仅影响细胞膜的透性，也会造成细胞结构和物理机械性损害，给细胞组织造成伤害。 由实验四可知，样品A的MDA含量（u mol/g）为 4.43x10-9。 样品B的MDA含量（u mol/g）为6.92x10-9，其中样品A的MDA含量明显小于样品B,又由于两种样品为同类植物，排除不同植物种类的抗逆性差异，植物器官衰老时，或在逆境条件下，往往发生膜脂过氧化作用，MDA是其产物之一，通常利用它作为脂质过氧化指标，表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱，样品A在低温胁迫下，MDA含量反而降低，说明在胁迫过程中，细胞膜结构和膜脂含量发生变化，使膜脂过氧化作用不能顺利进行，此过程中仍不能排除低温胁迫对酶活性的影响。 植物为了适应逆境条件（如干旱、低温等），也会主动积累一些可溶性糖，降低渗透势和冰点，以适应外界环境条件的变化。 实验五以样品在620nm的波长下的吸光度为观察可溶性糖变化的指标，可溶性糖含量越多，吸光度越小，实验五中，样品A的吸光度为0.428，样品B的吸光度为0.958，说明样品A中可溶性糖的含量增加。 综上实验，我们可以看出，八角金盘类植物抗逆性较差，在低温胁迫处理后，细胞膜透性增大，低温对植物造成不可恢复的伤害大，过氧化物酶的活性降低，细胞代谢减慢，膜结构及成分（如膜脂）发生变化，使得膜脂过氧化作用产生障碍，在逆境条件下，细胞开始大量积累可溶性糖，以度过不良环境。

【参考文献】 【1】郑国华，张贺英，低温胁迫对批把幼果细胞超微结构 及膜透性和保护酶活性的影响，热带作物学报，2008年12月第29卷第6期。 【2】 王学奎 主编，植物生理生化实验原理和技术（第2版）,高等教育出版社，2006年版。 【3】陈珂 徐刚 ，干旱胁迫对植物光合作用和活性氧代谢的影响，《安徽农学 通报(下半月刊)》 2009年16期。 【4】郑元，杨途熙，魏安智，宋晓军，杨向娜，低温胁迫对仁用杏几个抗寒生理指标的影响，西北农林科技大学学报（自然科学版），2008年1日第36卷第1期。 【5】王晓琴;玉米幼苗对水分胁迫的生理反应及其与品种抗旱性的关系研究[D];四川农业大学;2002年。 【6】侯嫦英;水分胁迫对青檀等树种生长及生理特性的影响[D];南京林业大学;2003年。 【7】康利平;干旱胁迫对豇豆幼苗生理生化及其显微结构的影响[D];内蒙古农业大学;2004年。 【8】史建伟;张育平;王国昌;环境胁迫对植物体内非结构性碳水化合物的影响[J];安徽农业科学;2007年09期。 【9】丁灿;杨清辉;李富生;林位夫;低温胁迫对割手密和斑茅游离脯氨酸含量的影

实验八 逆境处理对植物生理生化指标的影响

对植物产生伤害的环境称为逆境，又称胁迫。常见的逆境有寒冷、干旱、高温、盐渍等。逆境会伤害植物，严重时会导致植物死亡。逆境对植物的伤害主要表现在细胞脱水、膜系统受破坏，酶活性受影响，从而导致细胞代谢紊乱。有些植物在长期的适应过程中形成了各种各样抵抗或适应逆境的本领，在生理上，以形成胁迫蛋白、增加渗透调节物质（如脯氨酸含量）、提高保护酶活性 ( 等方式提高细胞对各种逆境的抵抗能力。

植物细胞膜起调节控制细胞内外物质交换的作用，它的选择透性是其最重要的功能之一。当植物遭受逆境伤害时，细胞膜受到不同程度的破坏，膜的透性增加，选择透性丧失，细胞内部分电解质外渗。膜结构破坏的程度与逆境的强度、持续的时间、作物品种的抗性等因素有关。因此，质膜透性的测定常可作为逆境伤害的一个生理指标，广泛应用在植物抗性生理研究中。 当质膜的选择透性被破坏时细胞内电解质外渗，其中包括盐类、有机酸等，这些物质进入环境介质中，如果环境介质是蒸馏水，那么这些物质的外渗会使蒸馏水的导电性增加，表现在电导率的增加上。植物受伤害愈严重，外渗的物质越多，介质导电性也就越强，测得的电导率就越高（不同抗性品种就会显示出抗性上的差异。）

脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水合能力，其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的疏水端可和蛋白质结合，亲水端可与水分子结合，蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的水，从而防止渗透胁迫条件下蛋白质的脱水变性。因此脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用，而且即使在含水量很低的细胞内，脯氨酸溶液仍能提供足够的自由水，以维持正常的生命活动。正常情况下，植物体内脯氨酸含量并不高，但遭受水分、盐分等胁迫时体内的脯氨酸含量往往增加，它在一定程度上反映植物受环境水分和盐度胁迫的情况，以及植物对水分和盐分胁迫的忍耐及抵抗能力。

植物体内脯氨酸的含量可用酸性茚三酮法测定。在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的有色产物，该产物在 520nm 有一最大吸收峰，其色度与含量正相关，可用分光光度法测定。该反应具有较强的专一性，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮试剂形成有色产物，碱性氨基酸对这一反应有干扰，但加入人造沸石（ permutit ），在 PH 1~7 范围内振荡溶液可除去这些干扰的氨基酸（如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸，精氨酸等 2 —氨基的氨基酸）。 [ 实验材料 ] 绿豆幼苗