显微镜的原理和使用

动方向不在同一平面上,因此无法干涉.为此在其后方向安置一块振动方向为 45°的检偏振器,使O,e光在同一振动面内.相干成像于显微镜的中间像面。

第五节 荧光显微镜 二、荧光特性

1. 分子不能将全部吸收的能量转变为荧光，部分能量以其它的形式释放，因此，荧光的效率总是小于1。荧光效率可由下式表示：

上式中发射光量子数即荧光强度，吸收光量子数即激发光强度，在一定范围内，

荧光强度＝荧光效率×激发光强度

激发光越强，荧光也越强。荧光强度由下式表示：

2.由于分子在无辐射跃迁中失去一部分能量，因此，发射荧光的能量总是比激发光能量小，发射荧光波长总是长于激发光波长。

3.一定物质在一定条件下有一定的激发（吸收）光谱和发射光谱的能力。因此，也就有最大激发（吸收）峰（Maximum Excitation-Ex)和最大发射峰(Maximum Emmision-Em)。吸收光谱偏向于短波方向，发射光谱偏向于长波方向，两者成镜像对称关系。同样，最大吸收峰波长短于最大发射峰波长（Ex

荧光显微镜采用落射光光路。为使人眼能在目镜中观察到发射荧光，在显微镜光路中必须采取两个措施：

1）落在标本上的光应为包括激发峰且具有一定带宽的单色光，通常由激发滤片来实 现。 2）对于从标本发出的光除发射荧光外，还有很强的被反射的激发光，且被标本反射的激发光的强度远远大于发射荧光的强度，因此，采用二色光分光镜和阻挡滤片双重 作用来抑制激发光到达目镜。 第五节 荧光显微镜

2.荧光滤片系统

1) 激发滤片：位于光源和物镜之间，作用是选择适于特定荧光物质的激发波长。 2)二色光分光镜：它的放置方向与激发光的方向呈45?，位于激发光滤片和发射光滤片之间，具有特征值M（lecica显微镜用RKP表示）。波长短于M的光被反射，波长大于M的光可通过，也就是说它对激发光具有高反射率，而对激发出的荧光具有高透过率，它是分离激发光（短波长）和发射荧光（长波长）的一个重要组件。

3)阻挡滤片：位于目镜之前。其作用是进一步使发射荧光与 激发光分离，以获得更纯的发射荧光。

第五节 荧光显微镜 4)荧光滤片的种类

a) 带通滤片(BP: Band Pass filter)

符号BP530/30 代表只允许波长在515-545nm 范围内的波长通过。 即以530nm为中心，带宽为30nm 。 常作为阻挡滤片和激发滤片。 第五节 荧光显微镜

b)长波通滤片(LP: Long Pass Filter)

符号LP530，代表只允许波长长于530nm的光通过，常作为阻挡滤片。

思考题：若激发光为蓝光，阻挡滤片分别为带通滤片BP530/30和长波通

滤片LP530时，在观察红绿荧光双标记的样品时效果有何差异?

c)二色光分光镜(Dichrome Beam Spliter) 符号 RKP510（Leica公司），代表510nm以下波长的光被反射，510nm以上波长的光可以通过。是荧光光路中最重要的滤片装置。

第五节 荧光显微镜 为了使用方便，常将激发滤光片，二色光分光镜及阻挡滤光片组合成一个模块。对于不同的荧光染色法，必须选用合适的模块才能得到满意的结果。 常用模块至少三类：

紫外光激发模块 UV 蓝光激发模块 B 绿光激发模块 G 法。

这些模块对应着不同染色法，如B模块常用FITC染色法，G模块常用TRITC染色

第六节 显微镜的使用

1.柯勒照明的调节：

a.用10×物镜将标本调节清晰。

b.可变视场光阑关至最小。

c.上下调节聚光镜，使可变视场光阑的多边形图像在目镜中清晰可见，

调节聚光镜调中螺钉，使可变视场光阑居中，打开可变视场光阑，使其外切于目镜视场光阑。

d. 拔出目镜，用肉眼直接观察物镜后焦面，调节可变孔径光阑，使可变孔径光阑的大小为物镜通光孔的2/3～3/4,插入目镜观察。或者不用拔出目镜，将可变孔径光阑的显示数字（1～8）设置为物镜数值孔径的7～8倍即可。

第六节 显微镜的使用

物镜的正确选择：

1.观察荧光时尽可能使用高数值孔径物镜。 2.物镜工作距离与样品厚度。

3.功能物镜与相应功能的配套使用。

4.注意盖片厚度对成像的影响。

5.聚光镜的数值孔径与物镜数值孔径的配合。