法医生物物证检验

用免疫电泳技术及聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳技术可将GC分成三种普通表型，即1-1型、2-1型、2-2型。 用等电聚焦电泳技术可分出六种亚型。 三、遗传规律

属常染色体上单基因座位共显性遗传，符合孟德尔遗传规律。 四、分型原理及方法 (一)分型原理

电泳结束后将其胶面与含抗GC血清的载体(如醋酸纤维素膜)结合形成抗原、抗体复合物蛋白质，然后再将其浸泡在蛋白质染色液考马斯亮蓝液中呈色、显出谱带判型。 (二)分型方法

1．免疫电泳，聚丙烯酰胺凝电泳(T＝5.8％，C＝2.14％)分普通型。 2．等电聚焦分亚型(T＝5％，C＝3％)。 五、亲子鉴定和个人识别的意义

由于该系统的表型分布频率好，个人识别率(DP)和非父排除概率较高，所以在个人识别和亲子鉴定中有重要意义。 第三节 同种异型遗传标记

同种异型血清型较常用的是Gm因子 一、概念

同种异型标记是免疫球蛋白分子上的抗原，其中IgG上的抗原称Gm因子。 二、遗传规律及特征

Gm因子按常规染色体共显性单倍型遗传 三、分型方法

分Gm(+)和Gm(-)二种型。检验方法： (一)红细胞被动凝集抑制试验；

(二)酶联免疫斑点法——Dot EliSA法； (三)免疫层析胶体金试剂盒的应用。 第八章 红细胞酶型

学习目的和要求：同工酶的分类，遗传多态性酶型的检验方法及在法医物证中的应用。 第一节 概 述

红细胞酶型是红细胞多态性同工酶个体间的遗传差异，是一个血型系统。

同工酶是指催化同一化学反应，而蛋白分子结构及理化性质不同的一组酶。它广泛地存在于人体组织和体液中。

在生物进化中，由于遗传变异，部分酶形成了变异体，这种由一个以上等位基因编码的酶变异体，在一群体中，若等位基因频率超过0.01，称为多态性同工酶，它是法医个人识别、亲子鉴定重要遗传标记。 一、同工酶产生的遗传学基础

同工酶的结构差异，是由不同的基因编码或蛋白合成后化学修饰造成的。根据同工酶的编码基因将同工酶大致分为以下几类： (一)复基因座位同工酶(遗传独立同工酶)

这类同工酶是由一级结构差异很大的多肽链按一定比例组装的杂化酶，而每一条多肽链的形成又是由不同的独立基因决定的。如磷酸葡萄糖变位酶(PGM)分别位于1、4和6号染色体，有三个基因位点，即 、 、 。 (二)复等位基因同工酶

生物群体中常会出现不同的等位基因，每一个基因表达一个变异的多肽链。复等位基因同工酶就是由同一位点上多个等位基因所编码的。如PGM1亚型的形成，就是由PCM1基因座的4种等位基因 、 、 、 、决定10种亚型。 (三)等位基因同工酶(遗传变异体同工酶)

这是由单一基因位点上的突变性等位基因所决定的同工酶。这类同工酶的发生是由亲代机体中的某一基因突变而出现了的等位基因所编码的一条特异性多肽链。 二、同工酶的分类：共6类 (一)氧化还原酶； (二)转移酶； (三)水解酶； (四)裂解酶； (五)异构酶； (六)连接酶。

三、在法医学中个人识别和亲子鉴定应用同工酶的条件 (一)识别率高；

(二)酶稳定，不易受环境因素的影响； (三)操作简便，重现性好； (四)分布广泛，取材方便； (五)酶活性易测定。

法医鉴定中常用的红细胞酶，有红细胞酸性磷酸酶，酯酶D、磷酸葡萄糖变位酶，乙二醛酶。 四、红细胞酶分型 电泳法

(一)分型的原理

1．同工酶的分离：电泳根据蛋白质的分子量和代电荷不同在电场中分开。

2．酶谱显示：用酶的专一底物，有酶的地方就显示出颜色反应，根据酶谱位置不同判型。 (二)检验方法

1．样品的处理：陈旧检材可用还原剂二硫代苏糖醇(DTT)浸泡。

2．电泳分离：所用的电泳介质有琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、醋酸纤维素膜、聚丙烯酰胺凝胶。 3．酶谱显示：电泳后凝胶上被分离的酶蛋白可采用特异的酶染色技术进行酶谱显示，其方法有： (1)荧光显色法； (2)电子转移显色法； (3)化学反应显色法； (4)酶偶联染色法； (5)底物呈色法； (6)放射自显影法。

第二节 红细胞酸性磷酸酶(EAP)

酸性磷酸酶(ACP)广泛存在于人体各组织中，其中在红细胞中的酸性磷酸酶为EAP，它们是一类水解酶。 一、遗传多态性

是一组定位在2号染色体上单基因座位复等位基因所控制多态性同工酶。由 、 、 三个共显性等位基因所编码，符合孟德尔遗传，分三种普通型。即A、BA、 在新疆发现了 ，很少见。 二、电泳分离，由以下几种介质 (一)醋酸纤维素膜，普通电泳； (二)琼脂糖凝胶，普通电泳； (三)淀粉凝胶，普通电泳；

(四)聚丙烯酰胺凝胶，等电聚焦电泳。 三、显色

以四甲基缴形酮磷酸盐为酶底物，荧光法显色 四、分型原则：

根据迁移率、荧光强度

检案中主要用于血液(斑)红细胞检验

三节 酯酶D(EsD)

EsD是一组水解羧酸酯键的酶类 一、遗传多态性

是由定位在13号染色体上一对等位基因 、 所编码，符合孟德尔遗传，分三种型即1-1、2-1、2-2型。后还发现一些稀有基因。 二、电泳分离，同EAP 三、显色

以四甲基分缴形酮醋酸盐为酶底物，荧光法显色 四、分型原则

根据迁移率，荧光强度划分

检案中主要用于血液(斑)红细胞和毛根 第四节 磷酸葡萄糖变位酶( )

PGM是在糖代谢当中将葡萄糖1磷酸变成6磷酸可逆反应中的一种变位酶。 一、遗传多态性

可分三个基因座位即 、 、 。其中 无多态性， 检材不易取，故就其多态性，主要研究 。 由定位在1号染色体上PGM 、PGM 所编码，分1-1、2-1、2-2三个普通型，偶见稀有型，由PGM 、PGM 、PGM 、PGM 编码分十个亚型。 二、电泳分离：同EAP

用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳分亚型 三、显色

偶联6磷酸葡萄糖脱氢酶，用电子转移法显色 四、分型原则 区带迁移率

检案中主要用于血液(斑)红细胞，毛根及精液(斑) 第五节 乙二醛酶(GLO1) 是一种还原酶类 一、遗传多态性

是由第6号染色体上GLO1 、GLO1 一对共显性基因控制，分三种型。即1-1、2-1、2-2型 二、电泳分离

由染色底物的要求所定。用碘显色法只能用淀粉和琼脂糖混合凝胶电泳法。 三、显色

用碘显色，属于化学测定法 四、分型原则 电泳迁移率

五、实际检案中选择酶型检验的原则

以上4种酶型是法医物证中常用的方法，当检材新鲜时首先考虑EsD，因4种酶中它的识别率最好(PGM1亚型识别率也高)。当检材较陈旧时，首先考虑PGM1，因其酶稳定性好。 识别能力

EsD(DP 0.61)>PGM1(DP 0.57亚型0.76)>EPA(DP0.41)>GLO1(DP 0.4) 稳定性

PGM >EAP>GLOI>EsD

此外还要考虑到检材易提取及该酶广泛地存在于各组织器官中。 第九章 DNA分析及其在法庭科学中的应用

学习目的和要求：DNA多态的概念及其有关知识，DNA多态性的分类，DNA指纹。聚合酶链反应技术及在法科学中的应用。 第一节 概 述

一、DNA的分子结构

DNA是由4种核苷酸组成的多聚体。 (一)核苷酸。 (二)碱基组成。

二、DNA的一级结构概念 三、DNA的二级结构

(一)DNA的二级结构概念。 (二)核酸的变性与复性。 1．变性

2．引起变性的因素： (1)温度：温度升高至80℃以上，叫热变性； (2)酸碱度：酸碱度引起的变性叫酸碱变性；

(3)有机溶剂：可以改变核酸溶液介质的介电常数使其变性。 3．复性

四、结构基因 (一)概念

(二)结构基因的组成

由前导序列，外显子，内含子及尾随序列组成。

1．外显子：为编码部分，大多数是单拷贝序列、高度保守。

2．内含子：为非编码部分，有单拷贝和多拷贝DNA序列之分。多拷贝序列又称重复序列，变异很大。 五、DNA多态性类型

(一)DNA多态性概念：DNA碱基序列的变异称为DNA多态性。 (二)多态性分类：分序列多态性及限制性片段长度多态性。 1．限制性片段长度多态性：

(1)限制性内切酶：这是一类能识别DNA分子内特殊序列的酶，能特异地与DNA识别序列内或附近的特殊位点结合，将双股DNA切开。 (2)限制性片段长度多态性(RFLP)：是指DNA限制性酶识别序列核苷酸结构发生改变，导致酶切位点产生消失或移位，酶切所产生的限制性片段数目及长度发生改变所呈现的DNA多态现象。 (3)产生限制性片段长度多态性分子结构基础的分类：

①点突变：指DNA序列中限制性内切酶识别位点发生单个碱基替换或修饰，使识别位点丢失或获得，以致限制性片段大小或数目发生改变，又称单碱基突变。 ②片段插入或缺失：在探针识别的限制性片段内有一段DNA插入或缺失，会使酶切割点的增多或消失，导致限制性片段大小发生改变。 ③重复序列数目的变异：

1)重复序列：以多拷贝形式存在的DNA序列。重复序列单元所在位置称基因座，按孟德尔定律遗传。 2)重复序列分类：可分为散在重复序列、串联重复序列及倒位重复序列三类。

串联重复序列：多个特定序列首尾相连组成的重复序列，又称卫星DNA；分4类(经典卫星、小卫星、中卫星、微卫星)，小卫星、微卫星因具有极高的多态性，是法科学研究的重点。

a可变数串联重复序列(VNTR)多态性。因具有高度多态性，称之为高变区。不同个体高变区所包含的串联重复序列拷贝的差异是VNTR多态性结构基础。

b短串联重复序列(STR)多态性。特点：STR与VNTR同样都是串联重复DNA序列，具有极高的多态性，亦按孟德尔定律遗传。只不过STR重复序列短，仅2-7个bp，是一种简单重复DNA，可用于降介DNA的鉴定。

2．序列多态性。序列多态性指某位点碱基排列的个体差异，它的形成和DNA碱基长度无关，主要与某位点上一个或多个核苷酸在不同个体中的变异有关。线粒体序列多态性就是一个代表。 (三)线粒体DNA(mtDNA)多态性

1．线粒体DNA多态性：属于序列多态性。每一个线粒体内一般含有一个双链环状的DNA分子，被称为线粒体DNA。人类线粒体DNA在个体之间存在大量的序列差异，这些差异主要存在于线粒体DNA非编码区的D环附近。

2．mtDNA遗传特征：mtDNA稳定地由母系遗传，由母亲传给子代，每个个体都是单倍体，只具有一种基因型。 利用mtDNA多态性可作母系单亲亲子鉴定。 3．染色体DNA与线粒体DNA的不同。

(1)染色体DNA。人类DNA约98％存在于染色体中。我们常指的DNA分析就是指染色体DNA。

(2)线粒体DNA。当染色体DNA严重降介时，鉴定线粒体DNA多态性，解决毛干、指甲等角质化组织的个人识别。 (四)分子杂交

1．分子杂交的概念：是指来源于不同DNA分子的二条非同源DNA单链，因部分碱基互补，在退火条件下，局部碱基配对，结合形成一条双链核酸的过程。 2．分子杂交的种类

(1)Southern杂交(膜上印迹杂交)： ①概念：是一种将经限制酶切的DNA片段，琼脂糖凝胶电泳分离后，转移至固相支持物上(硝酸纤维素膜或尼龙膜)再进行分子杂交的过程。 ②转移的方法：

1)毛细管转移法(southern转移法)； 2)电转移法； 3)真空转移法。 (2)斑点杂交法 ①概念：亦属于膜印迹杂交，只是提取的DNA不经酶切，电泳，而直接点样于硝酸纤维素膜上与探针杂交。此法用于性别、种属鉴定。 ②斑点杂交的改良法：

反向斑点杂交，狭缝杂交法两种。 (3)原位杂交。 ①概念：用标记的DNA或RNA探针直接在细胞和组织切片上进行分子杂交，与组织细胞中的DNA或RNA序列结合，形成杂交体，测DNA或RNA序列，称为原位杂交。 ②分类：根据探针标记物能否直接被检测分： 1)直接法 2)间接法

根据所用探针和靶核酸的不同可分： DNA与DNA杂交； DNA与RNA杂交； RNA与RNA杂交。 第二节 DNA指纹 一、DNA指纹 (一)概念

人体细胞核DNA经内切酶切割消化后可产生多个DNA片段，在低强度杂交条件下，一种多位点探针可与核心序列相同的DNA片段杂交形成多条谱带，个体之间不同，如同人的指纹故叫DNA指纹。 (二)DNA指纹分类

1．单位点DNA指纹：以串联小卫星核心序列DNA片段作为探针，在不同的杂交条件下，只检出单个VNTR位点的多态片段，称为单位点DNA指纹，亦称DNA纹印。

2．多位点DNA指纹：以串联小卫星核心序列DNA片段作为探针，在不同杂交条件下，同时检出多个位点的多态片段，称多位点DNA指纹。

(三)DNA指纹的本质及决定个体特异性的因素

1．本质：是基因组DNA的限制性片段长度多态性。 2．决定个体特异性的因素：

(1)是所用限制酶的识别序列特异性。 (2)是探针的特异性。 二、核酸限制性内切酶

(一)概念：简称限制酶，是一类能识别双链DNA中特定核苷酸序列的核酸水解酶，以内切的方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生DNA片段的5′端为P，3′端为OH。这类酶都是从原核生物(如细菌)发现的。

所谓限制是由于一些细菌中存在这类酶，它能限制外源DNA进入细菌内部，即进入后细菌以这种酶把外源DNA水解失去作用。 (二)限制酶的分类

限切酶识别核苷酸序列，多数是4-6个。识别4个核苷酸的限制酶大约4 ＝256个核苷酸就有一个切点，用它来切割大分子DNA可产生很多较小的片段，酶特异性低。识别6个核苷酸的限制酶大约4 ＝4096个核苷酸有一个切点，切点少，用它切割大的DNA分子产生小的片段较少，而大片段(长片段)增多，因此酶特异性较高。 DNA指纹技术中常用的限制酶有HaeⅢ、HinfⅠ、PstⅠ。 三、探针 (一)概念

DNA指纹技术应用的核酸分子探针是经示踪物<标记物)标记的，能与互补靶核酸序列实现退火杂交的已知核苷酸片段。均属于小卫星探针。

(二)探针分类 1. 根据来源分

2. 根据检测目的分：

(1) 单位点探针(单一序列探针)

(2) 多位点探针(重复序列探针)。单位点探针和多位点探针均属于小卫星探针。 (三)探针选择的基本原则

(四)探针的筛选和合成 1．多位点探针 2．单位点探针 (五)探针的标记

1．探针标记物的特征 2．探针标记物的分类： 单位点探针和多位点探针 (1)同位素标记 (2)非同位素标记

四、DNA指纹的基本特征

(一)多位点DNA指纹特征：具备人类遗传标记的各种特征

1．体细胞的稳定性人体各组织的有核细胞含有相同的基因组DNA,DNA指纹图是一致的，同一个体不同组织DNA指纹图相同。 有二种例外：

(1)人体酶不同组织间DNA甲基化存在差异，当使用对甲基化敏感的限制酶时，不能识别和切割甲基化酶的识别点，导致同一个体不同组织DNA指纹图不一致，所以要用耐甲基化限制酶。 (2)恶性变细胞与正常细胞DNA指纹不同。

2．孟德尔遗传方式与多位点探针杂交形成的大多数片段，尤其是4Kb以上的大片段，以均等的机会传给子代，子代所有的片段可在双亲的指纹中找到，片段的传递符合孟德尔的遗传分离律。

3．突变片段，在分析父、母、子的真三联DNA指纹，有时发现子代图谱中出现父、母皆无的“陌生带”，是突变形成的新片段。突变片段的出现主要是细胞在减数分裂过程中出现了基因交换与重组。亲子鉴定DNA指纹分析时要谨慎。

4．群体遗传学特征，在DNA指纹图上无法判定某片段来自哪一多态位点，各位点的基因型；也不能通过群体调查确定等位基因及基因频率分布等。在对DNA图进行统计学计算时要先进行一些“假设”等。多位点DNA指纹分析方法，统计学计算原则与一般遗传标记系统明显不同。

5．多位点DNA指纹的局限性 (1)需要检材量大，灵敏度低；

(2)要求检材要完整的大分子DNA； (3)多位点探针五种属特异性； (4)突变率高；

(5)不能解决2个或2个以上个体混合材料的个人识别；

(6)个体同一性概率，亲子关系概率及群体数据的统计学计算方法理论待完善。 (二)单位点DNA指纹特征

类似于一个由共显性等位基因控制的遗传标记系统

1．多态性片段的遗传方式单位点DNA指纹图上纯合子个体显示一条片段，杂合子显示二条片段。符合孟德尔遗传定律，子代的二条片段分别来自父、母。

2．高度多态性单位点DNA指纹是法医个人识别和亲子鉴定的有力工具。

3．突变率，突变率指每100次细胞减数分裂中新的突变片段出现数，它反应某探针位点的可信度，大多数单位点突变很低。 4．种属特异性单位点探针不仅有位点特异性还有种属特异性，与其他种属来源的DNA不杂交。 (三)单位点与多位点DNA指纹比较：从以下几点 1．靶DNA；

2．检材DNA量； 3．片段特征；

4．混合DNA检材； 5．种属特异性； 6．概率计算； 7．杂交条件。 五、DNA指纹技术

DNA指纹技术包括DNA提取，限制酶消化、电泳分离、印迹转移、探针的选择、分子杂交及DNA图显示。 (一)DNA提取

不同的检材，同样检材不同实验室及不同的检验目的提取的方法不同，但基本步骤一致。目前常用的方法： 1．有机溶剂法 (1)基本步骤： ①在弱碱和有蝥合剂存在的条件下，进行组织匀浆，破坏细胞膜和核膜。 ②用去污剂十二烷基磺酸钠(SDS)和蛋白酶K消化蛋白质，游离DNA。 ③用有机溶剂酚和氯仿萃取DNA，除去残余蛋白。 ④用乙醇沉淀纯化DNA。 (2)注意点： ①尽可能保证DNA分子的完整性，防止污染使DNA降解或机械损伤。 ②高温、反复冻融能破坏DNA分子中的某些化学键。 ③动作温和，尽量简化操作，缩短时间。 ④加蛋白酶K及有机溶剂量要足，尽可能的除去检材中的蛋白质等其他成分。 ⑤提取精细胞的DNA时还须加还原剂二硫苏糖醇(DTT)，使精细胞外膜的二硫键交联断裂，膜溶解释放出DNA。 (3)特点(优缺点)

优点：方法较稳定，提取的DNA量较多，并纯度较高，是提取精斑DNA较好的方法。

缺点：操作复杂，增加交叉污染的机会，检材中抑制物不易除净，不适合微量检材的提取。 2．chlex提取法

优点：简便快速，在一个试管里操作避免DNA丢失。Chelex对金属离子有螯合作用，而金属离子可使DNA降解。操作步骤简单减少抑制剂污染。

缺点：提取的DNA都是小片段，纯度较有机法差。 3．DNA纯化 (二)DNA定量

作DNA指纹图需要提取到足够量的DNA，限制酶消化DNA时要有最适比例，为此都需对DNA定量，常用DNA定量方法 1．分光光度法。

2．溴化乙锭—荧光法(琼脂糖凝胶电泳法)该法灵敏度高，操作简便，可测定浓度低于250ng／mlDNA溶液。 (三)限制酶消化 (四)电泳分离 1．琼脂糖凝胶。 2．聚丙烯酰胺凝胶。 (五)印迹转移

1．固相沪膜的选择常用的有： (1)硝酸纤维素膜。