(四) 无菌苗的培养(2016/3/11)
1. 培养基配制（方法同（二）培养基的配制与灭菌） 种子的萌发采用1/2MS培养基
1/2MS培养基 贮备液Ⅰ 12.5mL 贮备液Ⅱ 2.5mL 贮备液Ⅲ 2.5mL 贮备液Ⅳ 2.5mL 蔗糖 15g 琼脂 5g 2. 马齿苋（番茄）种子处理
1) 洗去浮尘和上漂的种子，挑选饱满种子，置于培养瓶中流水冲洗30min
后倒掉水备用；
2) 将种子置于培养瓶中，用75%酒精消毒灭菌30~60s，用无菌水冲洗干净； 3) 用1%升汞处理8~10min，然后用无菌水冲洗3~4次，放入无菌培养皿中，
置于酒精灯火焰下方，用无菌接种器械进行分离接种。
3. 接种及培养
1) 用酒精擦洗工作台和手，对接种器具进行灼烧灭菌；
2) 打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子（90%酒精浸泡并灼烧）将
培养材料置于培养基上，灼烧瓶口，盖上瓶塞。 3) 培养瓶贴上标签，做好标记，然后放到光照培养箱中或培养室培养架上进
行培养，条件为2000-3000LX，26±1℃，培养一周。
实验结果：所有马齿苋无菌苗均染菌（未拍照） 实验分析：①马齿苋种子消毒、灭菌时间不足
②接种室和培养实灭菌不彻底，环境较脏 ③实验操作不正确 ④超净工作台不干净
(五) 愈伤组织诱导(2016/3/25)
1. 培养基的配制（方法同（二）培养基的配制与灭菌）
愈伤组织诱导培养基
组别 一 二 三 四 6-BA 0.5% 0.5% 0.5% 1% NNA 0.5% 1% 0.5% 1% 贮备液Ⅰ 25mL 贮备液Ⅱ 5mL 贮备液Ⅲ 5mL 贮备液Ⅳ 5mL 蔗糖 15g 琼脂 5g 2. 无菌苗和外植体的处理
1) 无菌苗处理
从培养瓶中取出无菌苗，用无菌水洗净培养基，切成0.5cm大小，叶片较大的进行裁剪，置于无菌培养皿备用； 2) 外植体处理
a 将野外植物洗干净尘土并用洗衣粉刷干净；
b 将洗净植物切去叶柄，将叶片从叶脉处剪开，再切成3～4 mm2的小
块；嫩茎需切取两个节之间的节间部分，长约1 cm，流水冲洗30min； c 将外植体置于培养瓶中，用75%酒精持续消毒灭菌18s，然后用无菌
水冲洗
d 用1%升汞处理12~15min，然后用无菌水冲洗3~4次，放入无菌培养
皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌解剖刀切去两端后进行接种。
3. 接种及培养（同无菌苗的建立）
4. 剔除长菌严重的培养瓶，其余继续培养 5. 观察实验现象
实验结果： 组别 二 所有叶柄基部没有散开，一起消毒 75%酒精15s 升汞：15min 第一周(2016/4/8) 材马齿苋 料 结果 材料 马齿苋 盘龙参 根 盘龙参-叶绿色 盘龙参-叶基部 苜蓿（花+叶） 波斯菊叶 染菌率 100%（2） 0 0 0 0 0 盘龙参根 枯死率 0 100% 50%（1） 花-0 叶-50% 0 存活率 100%（2） 50%（1） 花：100% 叶：50% 100% 材盘龙参叶 料 盘龙参叶基部 结果 材苜蓿花+叶 料 结果 波斯菊叶
第二周(2016/4/15) 材苜蓿花+叶 料 结果 长愈伤组织 波斯菊叶 开始 愈伤组织长势良好 无变化
实验分析：
1、仅有无菌苗染菌：无菌苗本身染菌，但未被发现；
实验培养基凝固不彻底，粘到瓶子壁上； 培养基pH未调好； 操作时，动作不正确
无菌苗仅用无菌水洗涤，未用酒精和升汞 2、外植体有部分枯死：灭菌过度，时间过长
3、盘龙参组织无变化：可能由于培养基中植物激素不适宜，培养室温度、光照等不恰当 4、波斯菊长愈伤组织明显，此培养基较适宜波斯菊
5、不同植物对植物激素的要求不同，所以在同一浓度下出现不同的结果
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