三氯化铝比色法检测桑叶提取物总黄酮的研究

三氯化铝比色法检测桑叶提取物总黄酮的研究

Determination of Total Flavonoids in Mulberry Leaf Extract by Aluminium Trichloride Colorimetric Method

ZHANG Guoquan1，LUO Songfang2，HUANG Jianrong2，CAI Xiaoyan1，*ZHANG Yanjie1

（1. Juxiangyuan Health Food（Zhongshan）Co.，Ltd.，Zhongshan，Guangdong *****，China;

2. School of Food Science，Guangdong Phamaceutical University，Zhongshan，Guangdong *****，China）

Abstract：Used a kind of spectrophotometry taking rutin as the standard material and aluminium trichloride as the chromogenic agent，detection wavelength at 400 nm. The absorbance and the concentration of rutin exhibited a good linear relationship within the range of 1～16 μg/mL（R2=0.999 5），the average recovery rate was 100.44%. The relative standard deviation（RSD）of the precision，repetition and recovery was 0.28%，0.89%，0.92%，respectively. The method was simple and easily conducted with good reproducibility and accuracy，which could be used to determine the total flavonoids content in mulberry leaf extract.

Key words：mulberry leaf extract;total flavonoids;aluminium trichloride;colorimetric method

桑葉是药食两用的重要资源，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎抑菌、抗肿瘤等多种生理活性和保健功能，黄酮类化合物是其中一种主要的活性成分[1-2]。紫外-可见分光光度法是植物中总黄酮含量测定的常用方法，在紫外区直接测定或经显色后在可见光区测定，显色体系以亚硝酸钠-硝酸铝和三氯化铝的研究和应用最为广泛[3-10]。不同植物提取物中黄酮类化合物成分有差异，在采用分光光度法进行

含量测定时，对影响检测灵敏度和稳定性等方面的因素进行系统研究，有利于优化检测条件，提高方法的适用性。试验研究探讨三氯化铝比色法测定桑叶提取物总黄酮含量的影响因素，并对方法学进行考查，旨在更全面系统地评价检测方法的可靠性。 1 材料与方法 1.1 试剂与原料

芦丁（纯度≥95.0%），北京索莱宝科技有限公司提供;乙醇、氯化铝、乙酸、乙酸钠，均为分析纯;桑叶，购自当地药店。 1.2 仪器与设备

AEY-220型分析天平，湘仪天平仪器设备有限公司产品;SB-25-12DT型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品;TU-1901型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品。

1.3 试验方法 1.3.1 标准溶液的制备

精密称取芦丁标准品10 mg，用60%乙醇溶解，定容至100 mL，即配制成质量浓度为100 μg/mL的标准溶液。 1.3.2 样品溶液的制备

桑叶粉碎后过40目筛，以60%乙醇为溶剂，室温（25 ℃）超声辅助提取2次，每次30 min，料液比为1∶10（g∶mL），合并2次滤液得到样品溶液。 1.3.3 检测波长的确定

取2份1.3.1项中的标准溶液1 mL，分别置于 2支10 mL的比色管中。其中，一份加入pH值5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液1 mL，用60%乙醇定容，为未显色标准溶液;另一份加入5%三氯化铝溶液 1.5 mL，再加入pH值5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液1 mL，用60%乙醇定容，为显色标准溶液。取2份1.3.2项中的样液1 mL分别置于2支10 mL比色管中，同上法操作，分别为未显色样品溶液和显色样品溶液。以60%乙醇作为参比溶液，扫描上述4份溶液在190～700 nm波

长范围内的紫外可见吸收光谱。 1.3.4 显色条件对检测结果的影响

（1）三氯化铝添加量对吸光度的影响。分别取 9份标准溶液1 mL和9份样品溶液1 mL于10 mL比色管中，加入5%氯化铝溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5 mL，再加入pH值5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液1 mL，用60%乙醇定容。同时，制备空白组，以此作为参比溶液，测定波长于400 nm处的吸光度。

（2）缓冲液pH值对吸光度的影响。分别取5份标准品溶液1 mL和5份样品溶液1 mL于10 mL比色管中，加入5%氯化铝溶液1.5 mL，再加入pH值为2.5，3.5，4.5，5.5，6.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液1 mL，用60%乙醇定容。以空白作为参比溶液，测定波长于400 nm处的吸光度。

（3）显色时间对吸光度的影响。取标准品溶液 1 mL和样品溶液1 mL于10 mL比色管中，分别加入5%氯化铝溶液1.5 mL，再加入pH值5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液1 mL，用60%乙醇定容。以空白作为参比溶液，在显色10，30，60，90，120 min时，测定波长于400 nm处的吸光度。 1.3.5 方法学研究

（1）线性关系。分别取芦丁标准溶液（质量浓度100 μg/mL）0，0.10，0.25，0.40，0.55，0.70，0.85，1.00，1.15，1.30，1.45，1.60 mL于10 mL比色管中，依次加入5%的氯化铝溶液1.5 mL，pH值5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液1 mL，用60%乙醇定容。以空白作为参比溶液，测定波长于400 nm处的吸光度。以质量浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制工作曲线，得出回归方程。

（2）精密度。取1 mL标准溶液于10 mL比色管中，按照1.3.5（1）项中方法进行显色和测定吸光度。重复测定6次，计算相对标准偏差（RSD）。

（3）重复性。分别取6份1 mL样品溶液于10 mL比色管中，按照1.3.5（1）项中方法进行显色和测定吸光度，计算RSD。