2012-12-30 圆二色技术及应用

与溶液状态的蛋白CD光谱有差别, 特别在190nm后尤为明显; 并且溶液状态的CD 光谱拟合蛋白结构结果与由DSSP 方法计算的膜蛋白晶体二级结构有差别。所以他们认为, 现有的溶液参考蛋白体系不适合于CD 拟合预测膜蛋白二级结构, 提倡建立新的含有膜蛋白的参考蛋白体系。

在结构多变性方面, 蛋白质结构丰富多样, CD光谱方法将蛋白质结构分为4~ 5 个二级结构元件貌似有点粗糙; 螺旋的长度对[θ] 值有一定的影响, 这给不同螺旋长度的蛋白质数据拟合结果带来较大的误差, B2折叠的[θ] 值与其链长及链的数目有关, 并受环境影响比较大, 在CD光谱预测蛋白质二级结构的方法中可能会带来比较大的误差。另外, 在侧链基团CD 吸收影响方面, 由于二硫键及芳香氨基酸在远紫外CD光谱区也有不同强度的CD 峰, 蛋白质的远紫外CD光谱是包括肽键、芳香氨基酸及二硫键在内的[θ] 值贡献的加和, 这对以肽键电子跃迁产生CD 光谱为主要依据的远紫外CD 光谱拟合预测蛋白质二级结构的方法产生干扰, 有时甚至产生错误的结果。因此, 在采用参考蛋白拟合预测未知蛋白时,应该先尽可能的收集未知蛋白包括其它谱学在内的相关信息, 谨慎地采用相似结构的参考蛋白拟合预测其二级结构。 3 蛋白质近紫外CD 表征三级结构信息

蛋白质中芳香氨基酸残基, 如色氨酸(Trp) 、酪氨酸(Tyr) 、苯丙氨酸( Phe) 及二硫键处于不对称微环境时, 在近紫外区250~ 320nm, 表现出CD 信号。研究表明: 色氨酸在290 及305nm 处有精细的特征CD 峰; 酪氨酸在275nm及282nm 有CD 峰; 苯丙氨酸在255、260 及270 nm有弱的但比较尖锐的峰带; 另外芳香氨基酸残基在远紫外光谱区也有CD 信号; 二硫键的变化信息反映在整个近紫外CD 谱上。实际的近紫外CD光谱形状与大小受蛋白质中芳香氨基酸的种类、所处环境( 包括氢键、极性基团及极化率等) 及空间位置结构( 空间位置小于1nm的基团形成偶极子, 虽然这对CD 光谱的贡献不是很明显) 的影响。近紫外CD光谱可作为一种灵敏的光谱探针, 反映Trp、Tyr 和Phe 及二硫键所处微环境的扰动, 能应用于研究蛋白质三级结构的精细变化。冯永君等为了弄清火菇素蛋白的结构与功能的关系并揭示抗癌机理, 研究了火菇素的远紫外圆二色光谱, 测定了其在245~ 320nm 的近紫外CD 光谱, 发现二硫键和芳香氨基酸对CD 光谱有较大的贡献, 在268nm 处的CD 峰是苯丙氨酸的贡献, 酪氨酸的峰值在275nm左右, 因火菇素不含色氨酸, 故在290~ 310 没有峰值。总的来说, 在250~ 280nm之间, 由于芳香氨酸残基的侧链的谱峰常因微区特征的不同而改变, 不同谱峰之间可能产生重叠。

近紫外CD 光谱可以作为反映蛋白质三级结构变化的很有价值的指纹图谱, Krell 等研究了来自Streptomyces coelicolor 的野生型与突变型dehydroquinase 的远紫外与近紫外CD 光谱, 结果表明, 野生型与突变型dehydroquinase 的远紫外CD光谱几乎没有发生变化, 即二级结构没有发生明显变化, 而其近紫外CD 光谱却发生较为明显的变化, 即较之二级结构, 突变型dehydroquinase 的三级结构可能发生了较为明显变化。

4 圆二色技术的应用 4.1 蛋白类药物的质量控制

CD 拥有测样速度快、对样品的要求低、受干扰小等优点, 更加适用于蛋白类药物的质量控制。

4.1.1 蛋白稳定性的研究

蛋白类药物多不稳定, 易受环境因素如温度、pH 和浓度等的影响。基于CD 对蛋白构象反应灵敏的优点, 可以利用CD 来考察影响药物稳定性的外部因素, 寻找最佳的储存、使用条件。

生化类药物由于稳定性差多采用低压冷冻干燥法储存, 但是Taschner 等人研究发现该法降低了抗体MMA 383 体内的药效, 其药效仅在10% —20% 间, 而未经低压冷冻处理的样品其药效在80% —100% 间。CD 测定温度对其稳定性的影响表明, 在室温下两样品的二级结构没有差别, 皆含有29% 的β-折叠、14% 的α-螺旋、其余的为转角和不规则卷曲; 当温度由25℃升到50℃时, 二者变化也基本相同; 但是, 当温度由25℃降至11℃时, 在236nm 区域处出现差别, 经冷冻干燥的样品的图形变化比未经冷冻干燥的小。这部分的变化主要由肽键引起的, 因此实验者认为低压冷冻干燥降低了该抗体的柔性, 这可能导致体内药效的降低。Jovanovi’c 等以CD法研究超临界流体(SCF) 干燥过程中辅料对溶菌酶活性及二级结构的影响。分别测定溶菌酶水溶液、分别加蔗糖和海藻糖经SCF 处理后再溶解的样品, 三者的CD 图谱无差别, 证明辅料蔗糖或海藻糖在超临界流体干燥过程中有保护溶菌酶活性和其二级结构的作用。 4.1.2 蛋白结构确证

CD 被广泛用于蛋白二级结构确证的研究中, 不同厂家生产的仪器都带有用于结构分析的软件, 可以有效的计算出A2螺旋、B2折叠、转角、不规则卷曲的比例。目前, 国内外的研究焦点多集中在对蛋白二级结构的确证, 对三、四级结构的构型研究较少, 有待于各方面技术的进一步发展。沈岚等以CD 仪分析蛋白激酶B的PH 结构域的二级结构, 图谱经软件数据处理后计算得出α-螺旋、β-折叠、不规则卷曲的比例分别是1. 7%、80. 5%、17. 8% , 实验者所测定的结果与部分已知的PH 结构域具有相似的结构。Thiago 等人分别以CD法和分子动力学法考察人C-肽的结构, CD 实验结果表明该肽不存在无规则卷曲片段, 但是存在着一个局部稳定的结构, 该结果与分子动力学实验结果一致。

另一方面, CD 并不能提供结构方面的完整信息, 仍然需要与X 衍射、核磁共振等技术联合运用, 才能完整的表达蛋白、多肽等的结构信息。CD 在解决蛋白质的四级结构方面仍有困难, 即使与其他仪器联合应用也只能用于分析四级结构与二三级结构间

的相互关系。

4.2 手性化合物绝对构型测定

圆二色光谱是与化合物的光学活性相关的光谱, 可以提供许多分子的结构信息, 用于手性分子的结构测定, 判断分子的绝对构型。目前, CD 多用于植物药的绝对构型测定。早在20 世纪70年代, Gaffield就以CD 研究二氢黄酮的立体构型。随着CD 的广泛应用, 黄酮类化合物立体构型的研究也不断的深入。另外, Slade 等人就近年来CD 在黄酮类化合物立体构型研究中取得的成果进行了概括总结, 为黄酮类化合物立体构型的确定提供了准确而丰富的数据。Ferreira 等人则利用CD 确定了18 种黄烷23, 42二醇及其衍生物的绝对构型。当然, CD 在该方面的贡献也有赖于NMR、M S、IR 等的协同作用。 4.3 手性药物的含量测定

手性药物的含量测定多需要HPLC 与CD 的联用, CD 检测器的选择性高, 可以排除基质、添加剂等的干扰, 另外由于手性药物在临床中的广泛应用, 高效液相色谱圆二色检测器技术为今后确保用药的安全性将发挥越来越重要的作用。随着HPLC 圆二色检测器技术的进一步发展, 它将成为药用光学纯对映体制备、手性化合物代谢、对映体纯度的测定等研究领域重要检测手段。

圆二色检测器与液相色谱联用其最大的优点是可以实现非手性条件下对映体百分含量的测定。当圆二色检测器与液相色谱联用时, 一般来讲, 对于单一对映体, 在色谱图中可能出现正峰或负峰, 而外消旋体不出峰。如果对映体含量不同, 则色谱图上表现出的是占优势百分含量对映体的信号峰。对映体纯度的测定, 需要与紫外2可见光检测器串联使用, 同时测出圆二色光谱信号(ΔA ) 和紫外吸收信号(A ) , 其比率称为各向异性因子(g = ΔA/A ) , 仪器可以直接测出g 值。 5 展望

综上所述, 圆二色是研究溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法, 远紫外CD 数据能快速地计算出溶液中蛋白质的二级结构; 近紫外CD 光谱可灵敏地反映出芳香氨基酸残基、二硫键的微环境变化, 蕴含着丰富的蛋白质三级结构信息。随着现代分析仪器的飞速发展, 高压液相色谱、停流技术、电化学及荧光等附加装置与CD光谱仪器联用技术的应用, CD 已经广泛地用于了解蛋白质- 配体的相互作用, 监测蛋白质分子在外界条件诱导下发生的结构变化, 探索蛋白质折叠、失活过程中的热力学与动力学等多方面的信息。虽然紫外圆二色光谱预测蛋白质结构还存在着参考蛋白体系及计算算法有待进一步完善之处, 但随着人们对蛋白质CD理解的深入及CD 光谱技术的进一步发展, 其必将在蛋白质研究领域中发挥更加重要的作用。