CCK-8操作说明与检测步骤

CCK-8操作说明与检测步骤(总6页)

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DOJINDO操作说明

细胞活性检测

1. 在96 孔板中接种细胞悬液 (100 ml /孔 ) 。将培养板放在培养箱预培养 (在37 ℃，5% CO2的条件下 )。

2. 向每孔加入10 ml 的CCK- 8溶液 (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 值的读数) 。

3. 将培养板在培养箱内孵育 1-4小时。 4. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

5. 如果暂时不测定值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10 ml M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24小时内吸光度不会发生变化。

细胞增殖 -毒性检测

1. 在96 孔板中配制 100 ml的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养 24小时 ( 在37℃， 5% CO2的条件下 )。

2. 向培养板加入10 ml不同浓度的待测物质。

3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (例如: 6,12, 24 或48小时 )。

4. 向每孔加入10 ml CCK-8 溶液 (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 值的读数) 。

5. 将培养板在培养箱内孵育 1-4小时。 6. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

7. 如果暂时不测定值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10 ml M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24小时内吸光度不会发生变化。

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

制作标准曲线

1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。 2. 按比例 ( 例如：1/2比例 ) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。

3. 接种后培养2-4 小时使细胞贴壁，然后加 CCK-8试剂培养一定时间后测定 值，制作出一条以细胞数量为横坐标 (X轴) ，值为纵坐标 (Y轴) 的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量 (使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入 CCK-8后的培养时间)。

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DOJINDO检测步骤

CCK-8 检测步骤

1. 向各孔中加入100 μl细胞悬液。a) 2. 在37℃下预孵育培养板。b)

3. 向各孔中加入各浓度的待测溶液c)10 μl。 4. 37℃下孵育。

5. 向各孔中加入10 μl的CCK-8溶液d)。 6. 37℃下孵育1-4小时。e) 7. 测定450 nm处的OD值。

a) 使用适当的培养基制备50,000-100,000个/ml的细胞悬液。 b) 建议使用CO2培养箱过夜预培养。 c) 使用培养基或PBS来制备溶液。

d) 如果待测溶液有还原性，测定不含细胞，但含有CCK-8的待测溶液在450 nm处的空白吸光度。如果该吸光度很小，则可以直接加入CCK-8 ，如果吸光度相对较大，则需要除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的100 μl培养基和10 μl CCK-8进行检测。 e) 白细胞可能需要培养较长时间。

活力计算

细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100 A（加药）：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度 A（空白）：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度 A（0加药）：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度 *细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力

问答：

1.一个孔中应接种多少个细胞

当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

2.能否用384孔板进行试验

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