分子生物学技术实验指导2009版

实验三 质粒DNA的酶切、目的片段的纯化回收

[原理]

质粒DNA分子中含有限制性核酸内切酶的识别序列，如PUC质粒DNA含一个多克隆位点，在这个位点上具有EcoRI、BamHI、HindⅢ等十余种限制性核酸内切酶的识别序列，因此，在有关的限制性核酸内切酶的作用下，质粒DNA的环状结构可被切开，从而使之从共价闭环状或开环状转变为线状DNA。通过非酶切的质粒DNA及DNA分子量标准(mark)对照电泳可以鉴定分离纯化的质粒DNA。而且可以通过在紫外灯下切取含质粒DNA的凝胶，经高速离心或透析可回收质粒DNA片段。

[器材]

1、水浴锅 2、小平板电泳槽 3、电泳仪 4、Eppendorf管 5、微量进样器 6、移液器及吸嘴 7、透析袋 8、胶带 [样品]

PUC-tem载体和纯化的目的基因。 [试剂]

1、10×酶解缓冲液：购于供应酶的厂家。 2、限制性核酸内切酶EcoRI，Hind III

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3、入DNA分子量标准 4、1.0 % 琼脂糖凝胶 5、-20℃预冷无水乙醇 6、TAE缓冲液 [实验步骤]

一、质粒DNA的酶切

1、质粒DNA酶切反应液的准备:在Eppendorf管中依次加入 双蒸水 15 μl

10×酶切缓冲液 3 μl 质粒DNA 10 μl

EcoRI 酶液（10u/μl） 1 μl Hind III 酶液（10u/μl） 1 μl

2、将装有上述反应液的Eppendorf管于37℃水浴保温1小时。通过72℃水浴15 min终止反应，该反应液作为样品Ⅰ

3、以样品Ⅰ、未酶切质粒DNA样品和入DNA mark样品同时进行1.0 % 琼脂糖凝胶

电泳。

4、电泳结束后紫外灯下观察结果并照相。 二、电泳鉴定

以样品Ⅰ、未酶切质粒DNA样品和入DNA mark样品同时进行1.0 % 琼脂糖凝胶电泳 (取5μ样品，与1μl6*载样缓冲液混匀)，经1%琼脂糖凝胶（含0.5ug/ml溴电泳30分钟，电压为5V/cm。在紫外灯下观察扩增的DNA片段，鉴定待检标本中DNA片段。 三、PCR 产物纯化

1、按300ul Binding Buffer I/100ul PCR 产物的比例加入Binding Buffer I，混匀； 2、把混合液转移到套放于收集管的UNIQ-10柱中，室温放置2分钟，6000rpm离心1分钟；

3、倒掉收集管中的废液，加500ul Wash Solution到UNIQ-10柱中，8000rpm室温离心1分钟；

4、重复步骤3一次；

5、倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，12000rpm室温离心15秒； 6、将UNIQ-10柱放入一新的1.5ml离心管中，在柱子膜中央加30ul Elution Buffer或水

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（pH>7.0），室温或37℃放置2分钟。

7、2000rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段。 8、电泳检测回收的DNA片段。 注意：

⑴、Dnase、酚、SDS和高浓度的EDTA严重影响酶切效果，应避免污染。 ⑵、DNA纯度对酶切消化非常重要，蛋白质、RNA影响酶切。

⑶、不同限制性内切酶缓冲液主要差别在于其所含NaCl浓度。当要用两种或两种以上酶酶切DNA时，如果这些酶在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时酶切；如果这些酶要求不同，则按下列方法进行：a: 先用低离子强度的缓冲液中活性最高的酶消化DNA，然后加入适量NaCl及第二种酶，继续温育。B: 用一种酶消化DNA后，以酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，将DNA复溶后再用第二种酶消化DNA。

⑷、内切酶在50%甘油中-20℃是稳定的，但甘油影响酶切效果，故酶的加入量不能超过反应总体积的十分之一。

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实验四 DNA片段的连接

[原理]

质粒DNA与目的基因的DNA经同一种或两种限制性核酸内切酶消化后，产生具有相同的粘性末端或平末端的DNA片段，在DNA连接酶及ATP存在时，具有相同末端的DNA片段之间能重新生成磷酸二酯键，从而使DNA片段相互连接。 [器材]

1、冷冻恒温水循环仪 2、Eppendorf管 [材料与试剂]

1、T4 DNA连接酶(5U/μl)

3、EcoRI、Hind III 、质粒DNA 双酶切的质粒DNA 4、目的DNA片段（EcoRI、Hind III 双酶切） 5、5×T4 DNA连接酶缓冲液 [实验步骤]

1、连接反应混合液的准备：在Eppendorf管中依次加入： a、2.0 μl经EcoRI、Hind III 双酶切的质粒DNA b、4.0 μl目的DNA片段

c、2 μl 5 × T4 DNA连接酶缓冲液 d、1 μl T4 DNA连接酶 e、1 μl 重蒸水[1]

2、将Eppendorf管放入16℃水浴中过夜，反应产物用于转化。

注[1]：载体与目的基因的摩尔数之比应约为1：3-5 。当目的基因浓度过高（过低）时，可通过增加（减少）重蒸水和减少（增加）目的基因的加入量来调节。

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