河南科技大学 年产400吨淀粉酶生产工艺设计
年产400吨中性淀粉酶生产工艺设计
摘要：α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。本次设计的淀粉酶发酵厂，分别以玉米粉为碳源，以豆饼为氮源，以BF-7658枯草芽孢杆菌为生产菌种，采用深层发酵法，提取工艺采用盐析法，年产400吨淀粉酶。做出了生产工艺流程图，进行了物料衡算，设计了发酵罐和种子罐的尺寸和车间的布置和结构，同时绘制了该厂区的总平面布置图、带控制点的工艺流程图、工艺管道及仪表流程图图例。
关键词：α-淀粉酶；生产工艺设计；深层发酵法
1 绪论
1.1 淀粉酶简述
淀粉酶广泛存在于动物、植物和微生物中，在食品、发酵、纺织和造纸等工业中均有应用，尤其在淀粉加工业中，微生物淀粉酶更是应用广泛并已成功取代了化学降解法；同时，它们也可以应用于制药和精细化工等行业。
α-淀粉酶是淀粉及以淀粉为材料的工业生产中最重要的一种水解酶。现在，α-淀粉酶已广泛应用于食品、清洁剂、啤酒酿造、酒精工业、纺织退浆和造纸工业，对缩短生产周期，提高产品得率和原料的利用率，提高产品质量和节约粮食资源，都有着极其重要的作用。α-淀粉酶来源广泛，主要存在发芽谷物的糊粉细胞中，当然，从微生物到高等动、植物均可分离到，是一种重要的淀粉水解酶，也是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。它可以由微生物发酵制备，也可以从动植物中提取。不同来源的α-淀粉酶的性质有一定的区别，工业中主要应用的是真菌和细菌α－淀粉酶。目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业，是一种重要工业用酶。有报道表明，α-淀粉酶可以帮助改善糖尿病患者的耐糖量。这一领域研究自2O世纪8O年代和9O年代十分活跃，但目前α-淀粉酶抑制剂的研究工作仍处于基础阶段，至今仍未得到有效合理的开发应用。但是随着科技的发展、研究的深入，α-淀粉酶将会得到更加广泛的应用。
2 α-淀粉酶的性质
2.1 α-淀粉酶的结构
目前，已对很多不同种类和来源的α-淀粉酶（黑曲霉、米根霉、人和猪胰腺、人唾液腺、大麦种子和地衣芽孢杆菌)的晶体结构进行了X-射线衍射研究，并得到了高分辨率的晶体结构图。研究表明所有α-淀粉酶均为分子量在50ku左右的单体，由经典的三个区域(A、B、C)组成：中心区域A由一个(β/α)8圆筒构成；区域B由一个小的β-折叠突出于β3和α3之间构成；而C-末端球型区域C则由一个Greek-key基序组成，为该酶的活性部位，负责正确识别底物并与之结合。为保持α-淀粉酶的结构完整性和活性，至少需要一个能与之紧密结合的Ca2+，而Cl-往往是α-淀粉酶的变构激活因子，并且在所有Cl-依赖性的α-[10]
淀粉酶中，组成催化三联体的残基都是严格保守的。
2.2 α-淀粉酶的性质
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早在1967年，Jones 和Varner就对小麦中α-淀粉酶的活性进行了研究。不同来源的α-淀粉酶的酶学和理化性质有一定的区别，它们的性质对在其工业应用中的应用影响也较大，在工业生产中要根据需要使用合适来源的酶，因此对淀粉酶性质的研究也显得比较重
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要。
2.2.1 底物特异性
α-淀粉酶和其它酶类一样，具有反应底物特异性，不同来源的淀粉酶反应底物也各不相同，通常α-淀粉酶显示出对淀粉及其衍生物有最高的特异性，这些淀粉及衍生物包括支链淀粉、直链淀粉、环糊精、糖原质和麦芽三糖等。
2.2.2 最适 pH和最适温度
反应温度和pH对酶活力影响较大，不同来源的α-淀粉酶有各自的最适作用pH和最适作用温度，通常在最适作用pH和最适作用温度条件下酶相对比较稳定，在此条件下进行反应能最大程度地发挥酶活力，提高酶反应效率。因此，在工业应用中应了解不同的酶最适pH和最适温度，确定反应的最佳条件，最大限度地提高酶的使用效率是很重要的。
通常情况下α-淀粉酶的最适作用pH一般在2到12之间变化。真菌和细菌类α-淀粉酶的最适pH在酸性和中性范围内，如芽孢杆菌α-淀粉酶的最适pH为3，碱性α-淀粉酶的最适pH在9～12。另外，温度和钙离子对一些α-淀粉酶的最适pH有一定的影响，会改变其最适作用范围。不同微生物来源的α-淀粉酶的最适作用温度存在着较大差异，其中最适作用温度最低的只有25℃～30℃，而最高的能达到100℃～130℃。另外，钙离子和钠离子对
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一些酶的最适作用温度也有一定的影响。
2.2.3 金属离子
α-淀粉酶是金属酶，很多金属离子，特别是重金属离子对其有抑制作用；另外，巯基，N-溴琥珀酸亚胺，p-羟基汞苯甲酸，碘乙酸，BSA，EDTA和EGTA等 对α-淀粉酶也有抑制作用。
α-淀粉酶中至少包含一个Ca2+，Ca2+使酶分子保持适当的构象，从而维持其最大的活性和稳定性。Ca2+对α-淀粉酶的亲和能力比其它离子强，其结合钙的数量在1到10之间。结晶高峰淀粉酶A(TAA)包含10个Ca2+，但只有一个结合很牢固。通常情况下结合一个Ca2+就足以使α-淀粉酶很稳定。用EDTA透析或者用电渗析可以将Ca2+从淀粉酶中除去，加入Ca2+可以激活钙游离酶。用Sr2+和Mg2+代替TAA中的Ca2+，在Sr2+和Mg2+过量的情况下也能使其结晶。加入Sr2+、Mg2+和Ba2+离子可以激活用EDTA失活的TAA。通常情况下，有Ca2+存在淀粉酶的稳定性比没有时要好，但也有报道α-淀粉酶在Ca2+存在时会失活，而经EDTA处理后却保留活性，另外，有报道称Ca2+对α-淀粉酶没有影响。
2.2.4 电场强度
实验结果表明，不同强度电场导致酶活性增加的效应不同，并且呈非单调性变化。我们认为，不同强度电场对酶蛋白分子的构象产生了不同影响，处理酶所用的电场能量虽然不足以改变酶蛋白氨基酸序列，但可以改变酶蛋白的构象．姚占全等[13]用不同强度电场处理α-淀粉酶5min，处理后分别在第1天与第1O天测定电场对α-淀粉酶活性的影响。第1天测定结果表明，电场对酶产生明显影响，而且不同强度电场对α-淀粉酶活性的影响程度不同，在0.5～6.0kV／cm范围内，酶活性随场强增加呈非单调性变化，与对照组相比，变化幅度在5.5%～26.2%之间。第1O天测定，酶活性变化幅度在0.2％～16.3%之间，表明电场对酶产生的影响经过一定时间后趋于消失。
3 工艺流程设计
3.1菌种的选育
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3.1.1菌种的选育及制备
菌种选择性分离的步骤一般是：
含微生物材料采集——标本材料的预处理——菌种的分离——富集培养——菌种初选——菌种复选——性能鉴定——菌种保藏。 1） 含微生物材料的选择
土壤是微生物聚集最丰富的场所，菜园和农田耕作层土壤含有丰富的有机物常以细菌和放线菌居多，由于枯草芽孢杆菌生活在中性的环境中，可以采集中性的土壤。 采土时先用小铲除去表土，取5～15㎝深处的土样，选好3～5点，每点取土10g混在一起装入灭过菌的牛皮纸袋，并记录时间、地点、植被等情况。 2 ）预处理
在培养过程中以淀粉作为唯一或主要碳源，控制pH在 6.7～7.2。那些在所采用的条件下最适用于淀粉代谢的微生物最终将占优势，并可在淀粉琼脂糖平板上分离到产生中性淀粉酶的菌株。
3） 所需菌种的纯化和分离
可用平板划线法进行菌种分离。方法如下：用接种管蘸取少量经增殖培养后的菌液，在含无菌固体培养基的平板表面上进行规则划线，操作时由右向左轻轻划线，划线时平板面与接种环成30°～40°，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，线条要平行密集，使两线不能重叠，充分利用表面积，划线时接种环不要嵌入板内划破培养基，密集的含菌样品，经过多划线稀释，使菌体在平板培养基上逐渐分离成单个菌株，经培养繁殖成单个菌落，反复进行几次平板划线分离，可得枯草芽孢杆菌野生菌株。 4 ）菌株的培养
常用培养基配方：1L蒸馏水+10g蛋白胨+3g牛肉膏+15～20g琼脂+5gNaCl。本课题以麸皮、豆饼粉作为天然培养基，在37℃保温箱中培养，至培养基中部分出现成熟颜色即可进行保藏。 5 ）菌落的选择
初筛采用透明圈法，方法为在培养基里接入淀粉天青，接入含菌样品后，可在菌落周围清晰地观察到淡蓝色晕环，初筛选出的微生物经过菌株性状试验后已确定具有一定生产能力的菌株还要进行复筛。
方法：将初筛后的少数菌株接种于40 ml 锥形瓶内的液体培养基中，110次/min 往复式摇床式震荡培养，得到摇瓶种子。 3.1.2 诱变育种
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诱变育种可以利用物理、化学因素诱导遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求如高产的个体，进而培育成新的品种或种质。
诱变育种操作程序如下：
出发菌株→纯化→培养液→细胞或孢子悬液→诱变剂处理→中间培养→平板分离→初筛→复筛→生产性能实验→菌种保藏。 1） 出发菌株的选择
由于野生型菌株生产性能较差，通常采用经历过生产条件考验的菌株，即经过液体培养的摇瓶种子，这类菌株一定的生产性状，对生产环境有较好的适应性，正突变的可能性也很大。
2） 菌悬液的制备
细菌一般要求处于对数生长中期的菌，用玻璃珠振荡5 min，使细胞均一分散，然后用灭菌脱脂棉过滤，得到分散菌株。菌悬液的细胞浓度不宜过高，本课题中的枯草芽胞杆菌，宜将其浓度控制在108个/ml。菌悬液介质一般用生理盐水。 3） 诱变剂的处理
诱变剂包括物理、化学、生物诱变，在微生物诱变育种中，可用物理化学复合诱变因素处理菌种，这样可以扩大培养幅度，提高诱变效果获得中性淀粉酶高产突变株。方法及步骤如下：
吸取制备好的枯草芽孢杆菌悬液5 ml于直径为6㎝的无菌培养皿中，然后用0.5%～1%的二乙酯处理30 min，处理时采用pH 7.0的磷酸缓冲液，再将磁力搅拌器于紫外灯下（距离30 cm）1 min，接着在红灯下吸取经处理的菌液0.5 ml，稀释至10-6，取10-6～10-1稀释液滴一滴于6个平板中，10-6～10-1 依次涂布均匀，再置暗箱内与37℃培养48 h。
注意：一般化学诱变剂均有毒性，多数还具有致癌作用，故操作时切忌用口吸取并勿与皮肤直接接触，做好安全工作。 4）突变菌株的筛选
包括：琼脂块透明圈法初筛。
方法：倒入选择培养基6皿，取其中较厚的2皿，用打孔器或玻璃打制圆形培养基→平移琼脂块至一个选择平板上，再用接种针挑取单菌落的少量菌体分别接种于琼脂块中心并与一琼脂块接入出发菌株作为对照→正置于37℃培养45小时→于培养好的选择平板中滴加几滴淀粉天青，观察到透明圈的直径→选择透明圈大的菌落接入斜面备复筛用。
摇瓶发酵复筛：将经初筛处的菌株分别接入增殖培养基中，培养13小时→分别接种于
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