第39章 基因工程及蛋白质工程 - 图文

第三十九章 基因工程及蛋白质工程

第一节 DNA 克隆的基本原理

基因克隆的技术路线大致包括以下几个程序：分离制备待克隆的DNA 片段（目的DNA）；在体外连接目的DNA 片段和载体；重组DNA 分子转入宿主细胞；筛选、鉴定阳性重组子；重组子的扩增。

一．DNA 限制酶与连接酶

类型Ⅰ限制酶为多亚基双功能酶，S 亚基为识别亚基，识别位点为两部分序列，中间有一定长度的任意碱基对，M 亚基有甲基化酶活性，R 亚基为切割亚基，可在识别位点1kb 以上处随机切割。

类型Ⅱ限制酶有两个相同的亚基组成，识别位点为4~6bp 的回文序列，切割位点在识别位点内，或靠近识别位点，经切割可以生成平头末端或粘性末端，可以产生相同粘性末端的不同的限制酶称作同尾酶。

类型Ⅱ限制酶是分子生物学中最重要的工具酶。

类型Ⅲ限制酶为两个亚基的双功能酶，M 亚基为识别亚基，R 亚基为切割亚基，切割位

点在识别位点下游24~26bp 处，特异性不强。 EcoRI 与DNA 的复合体：

外源DNA 可以被插入质粒载体：

限制性内切酶切割DNA 形成对应的粘性末端：

使用相同的粘性末端进行重组，会有较多的载体自身环化，或目的基因串联，目的基因的定向连接常使用两种限制酶，产生两种不同的粘性末端。

可以在载体和目的基因的两端连接接头（引入限制酶切点），或衔接物（含有粘性末端），再连接载体和目的基因。

接头用于建立克隆片断的末端：