实验方案
设计人：陈龙
1．蛋白酶产生菌的分离 1. 1 实验材料
菌源：酱香型大曲
1. 2 培养基的配制
细菌培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏3g、蛋白胨 10g、NaCl 5g、琼脂 15-25g、水 1000ml；
称量：分别准确称取上述蛋白胨和NaCl量置于烧杯中，然后加入所需水量的2/3左右的蒸馏水；牛肉膏用玻璃棒挑取置于小烧杯或是表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯中。
溶化：在上述烧杯中先加少许所需要的水量，将烧杯置于石棉网上加热，用玻棒搅拌，让药品完全融化，补充水到所需的总体积。
调PH：在未调PH前，先用PH试纸预测培养基原来的PH，若偏酸用1 mol/L NaOH调节边加变搅拌，并随时用PH试纸检测至PH到7.2。反之，用0.1 mol/LHCL进行调节。 分装、包扎、灭菌。
霉菌培养基（察氏培养基）：蔗糖 30g、NaNO3 2g、K2HPO4 1g、KCL 0.5g、MgSO4.7H2O 0.5g、FeSO4 0.01g、琼脂 15-25g、蒸馏水 1000ml；
量取所需水量约2/3左右加到烧杯中，分别称取上述物品依次逐一加入水中溶解，方法同细菌培养基。分装、包扎、灭菌。
产蛋白酶发酵培养基：葡萄糖20g， 酵母粉15g，K2HPO4 1.0g， Na2CO3 0.1g，自来水 100ml PH 9.0（灭菌前）。pH7．0。
配制方法：称取葡萄糖20g，酵母膏15g置于洁净干燥500ml锥形瓶轻轻摇动，使物料混匀，按上述配方用自来水配制无机盐溶液50ml，调节Ph 9.0,倒入装有物料的锥形瓶中混匀，在0.1Mpa压力灭菌30min。
选择培养基：豆粕粉 10．0 g，琼脂 15．0 g，蒸馏水 1000 mL，pH7．2～7．4，112℃，灭菌 30 min。
固体斜面培养基：250mL三角瓶装料12.5g麦麸，麦麸：水=1：1.2，pH自然，121℃灭菌30min。
筛选平板：牛肉膏蛋白胨培养基（配法同上）。
1. 3
试剂和溶液
1.3.1 配制生理盐水：分装于250ml锥形瓶，每瓶内装99ml，并装10粒玻璃
珠。分装试管，每只装9ml。
1.3.2 0.4mol/L 三氯乙酸溶液：三氯乙酸6.54g，蒸馏水 100ml，定容。
1.4 仪器
722型可见分光光度计、；FZ-2004型电子天平、LRH-250A 型生化培养箱、
接种针、接种环、无菌器材等。
1.5 分离方法
1．5．1 产蛋白酶菌株的分离称
取样品1g，在无菌条件下放入盛有99ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡10min，使样品与水充分混合，制成10-2的菌悬液。振荡混匀后静置，按10倍稀释法分离制备取10-3、10-4至10-7。取5支盛有9ml菌水试管，按10-3~10-7编号，放置在试管架上。用1ml的无菌移液管准确吸取1ml 10-2的稀释液，在无菌条件下放置于10-3试管中。以此类推，制成10-4~10-7等各种稀释度的溶液。取无菌培养皿9个，皿底按稀释度编号（每个稀释度3个），用无菌移液管吸取大曲样品的10-5、10-6、10-7稀释度各1ml放置于培养皿中。
用倾注法分离产蛋白酶菌株，待灭菌后的细菌培养基、霉菌培养基冷却到55℃左右，在超净工作台上迅速倒置于接种过的培养皿中，每个培养皿大约倒15ml。(注意温度不要过高，以免高温杀死产蛋白酶菌株及高温产生水汽在皿盖上易染杂菌)
待平板冷却后倒置于37℃的恒温箱中培养24~28h，观察结果。观察分离培养基平板长出的菌落周围有无明显的透明水解圈，挑选能产生透明圈且水解圈D/d较大者的单菌落，接种至筛选平板上划线分离至纯种，得到纯化后的菌株观察其个体形态和群体形态，保藏斜面，纯化后得到的纯种菌株用Biolog全自动微生物鉴定仪对所得菌种进行鉴定。
2．酶活力的测定方法
2.1 酶活力定义： 1 min内由酪蛋白释出的三氯乙酸可溶物在 275 nm的光
密度与 1 ug酪氨酸相当时,其所需要的酶量为 1个单位。
2.2酪氨酸标准曲线的绘制
分别取质量浓度为 0～60 mg／mL的溶液各 1 mL，各加入浓度0.4 mol/L的Na2CO3溶液 5 mL，福林试剂使用液各1 mL置于(4O±0．2)℃水浴锅中显
色20 min，取出，然后用分光光度计在波长680 nm和10 nm比色皿测定OD680 值，以不含酪氨酸的试管为空白对照。以吸光度A为纵坐标，以酪氨酸浓度为横坐标 ，绘制标准曲线。用作图或回归方程法计算出标准曲线的相关系数。当吸光度为1时，酪氨酸的量为1 mg，即为吸光度常数K值。
2.3 酶液的制取
将筛选菌种以5﹪的接种量至100ml发酵培养基中，25℃振荡培养48h。发酵液于3000r/min离心15min，取上清液得酶液。
2.4 酶活力的检测方法
取 5 mL用pH值为8的硼酸缓冲液制备的质量分数为0.6％的酪蛋白溶液于试管中，40℃下预热 2 min后，加入1 mL体积数5％，pH值为8的蛋白酶硼酸稀释液于试管中，40℃下反应10 min后，加入5 mL浓度为0．4 mol/L的三氯乙酸终止反应，沉淀残余底物，40℃下保温 20 min，使沉淀完全，用漏斗加滤纸过滤，滤液用紫外分光光度计测定波长275 nm的光密度。
另以先加入三氯乙酸使酶失活，后加人酪蛋白的试管，按上述同样步骤测定光密度，作为空白对照。
3. 蛋白酶产生菌产酶条件研究 3.1 初始PH值对酶活力的影响
将所得的菌种采用不同初始 pH的发酵培养基进行研究进行发酵，制备粗酶液。在温度为40℃下，恒温培养48h，测定各PH值下发酵液的酶的活力，然后根据得出的结果选择最适PH。
3.2温度对酶活力的影响
将所得的菌种选用3.1所得的最适pH的发酵培养基，分别在 25、30、35、
40、45℃的条件下培养 48 h，制备粗酶液，测得各温度下的酶活力，根据测得结果选择最适温度。
3.3 氮源对酶活力的影响
以NH4Cl、硫酸铵、尿素、豆粉饼、蛋白胨和酵母膏这六种不同氮源代替产蛋白酶发酵培养基B中的酵母粉发酵，以初始pH为3.1中所得最适PH，在3.2条件下所得最适温度下发酵培养72h，测定不同氮源发酵液中蛋白酶活力，最后根据测得结果得出蛋白酶产生菌产酶最适氮源。
3.4碳源对酶活力的影响
以玉米粉、麦芽糖、可溶淀粉、糊精、葡萄糖和蔗糖这六种不同碳源代替发酵培养基的葡萄糖发酵，以蛋白胨为氮源， PH为自然条件，测定发酵液弹性蛋白酶活性，每个样本设计3个平行，求得平均值，并将实验结果进行方差分析。最后根据所得结果得出最适碳源。
3.5 碳氮比对酶活力的影响
由于发酵培养基中的酵母浸粉提供生长因子并可以提供少量氮源，根据前期结果，现以葡萄糖为碳源，硫酸铵和酵母浸粉为氮源，作三因素三水平正交试验。以最高酶活力为 100％，考察不同碳氮比例对产酶的影响，最后根据正交实验的结果选择最优碳氮比。
3.6水分对酶活力的影响
以麦麸为培养基，加水量不同，pH值自然，30℃温度下发酵培养5天，测定酶活。
3.7无机盐对酶活力的影响
在发酵培养基中分别加入K2HPO4 、KH2PO4、Na2HPO4 、NaH2PO4 、MgSO4 、Na2HPO4等6中无机盐代替原培养基中的无机盐，在37℃下培养72h，观察不同无机盐对产酶的影响，根据结果得出最适无机盐。 3.8生长因子对酶活力的影响
在制备发酵培养基中分别加入氨基酸、维生素外、蛋白质、糖类、脂类进行编号，制备好培养基后将所得菌株接种在加入生长因子的培养基中，培养72h观察产蛋白酶的透明圈的大小，在利用蛋白酶活力计算公式计算加入不同生长因子产酶的活力，根据所得结果得出适合蛋白酶产生菌产酶的生长因子。 3.9湿度对蛋白酶产生菌产酶的影响
在培养蛋白酶产生菌的细菌培养基中加入不同的水量，制备6个不同水量的培养，以控制培养基中水分的不同，将所得的菌株接种在培养基上观察产生产生透明圈的大小判断湿度对蛋白酶产生菌产酶活力的影响。
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