哈工大大一年度项目立项报告

编号：

哈尔滨工业大学 大一年度项目立项报告

项目名称：关于利用拜氏梭菌制丁醇的培养基条件优化 项目负责人：xxx 学 号：xxxxxxxxxx 联系电话：xxxxxxxxxxxxxxxxx 电子邮箱：xxxxxxxxxxxxxxxxxx 院系及专业：xxxxxxxxxxxxxxxxxxx

指导教师：xxx 职 称：xxx

联系电话：xxxxxxxxxxx 电子邮箱：xxxxxxxxxxxx

院系及专业：xxxxxxxxxxxxxxxxxxx

哈尔滨工业大学基础学部制表 填表日期：2016年11月05日

1

一、项目团队成员

姓名 xxx xxx xxx 性别 x x x 所在院系 xxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxx 学号 xxxxxxxxx xxxxxxxxxxxx xxxxxxxxx 联系电话 xxxxxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxxxxx xxxxxxxxxx 本人签字 二、指导教师意见 签 名： 年 月 日 三、项目专家组意见

批准经费： 元组长签名：（ 学部盖章 ） 年 月 日 2

四、立项报告

关于利用拜氏梭菌制丁醇的培养基条件优化

（一）立项背景

1.丁醇的广阔应用背景及制备现状

丁醇作为一种重要的化工产品原料有着极其重要的地位，可用于传统的浓硫酸催化合成醋酸丁酯工业；与苯酐经硫酸催化制二甲苯二丁酯（DBP），作为增塑剂；与丙烯酸合成丙烯酸丁酯，作为一种重要的聚合单体，广泛应用于涂料、油墨、纺织、皮革、造纸、胶黏剂、橡胶、塑料等领域。丁醇还由于自身良好的物理化学性质应用于冶金工业作为TMK（测定金的显色剂）的理想溶解剂；在病理组织制片中起到脱水、透明的双重作用，可使组织完全脱水，不需要根据材料而变化，且组织不会变硬变脆或收缩，对医务人员无任何副作用，取代了常规的乙醇和二甲苯。此外，丁醇还由于高热值、挥发性小、腐蚀性小，可与汽油、柴油混合且不需要对车辆进行改造，可使用现有的石油供应和分销系统而成为仅次于乙醇第二大可再生能源[1]。因此使用丁醇作为新一代可再生能源能够降低国内对石油进口的依赖性，实现燃料类型多元化，缓解因石油引发的国际关系紧张等一系列因化石燃料短缺带来的国际性问题。

工业上比较成熟的丁醇生产方法有3种：醇醛缩合法、羰基合成法和发酵法。其中醇醛缩合法和羰基合成法均属于化学合成法，二者都以石油为原材料，随着石油产量的降低以及中东国家对石油控制的加强，近几年这两种投资相对较大，而且对技术设备要求较高，已经不再适用。微生物发酵法以原料来源广泛、价格低廉、工艺设备简单、投资小、生产条件温和、不需贵重金属催化剂、安全性高、选择性好、副产物少，易于分离纯化、温室气体排放量少等优点逐步成为制丁醇的主要途径[2]。 2.生物发酵法制丁醇工业的现状和问题

目前生物发酵法仍然有着巨大的发展空间，丁醇的市场很大，但是产量却并不能满足需求。生物制丁醇工业还有巨大的改进和科学研究空间。只有进行进一步的科学研究才能发挥其成本低廉的优势，产生巨大的生产效益。生物法制丁醇现存的主要问题是产量低下、发酵周期长，发酵产物对菌种的毒性比较大，会在发酵过程中产生较大的毒性，导致菌种不能正常生长，最终影响到生产的周期和产量[3-4]。其次，在培养的过程中，培养基的成分以及含量会对发酵周期及产量产生影响，各种不同的化学因子以及化学因子的量会对培养基及结果有着或好或坏的影响[5]。通过培养基成分的优化研究是解决丁醇产量和周期问题的重要途径。 3.课题研究意义

通过研究生物发酵制丁醇时培养基各组分及其相互作用对丁醇产量的影响，以解决工业制丁醇时产量低下以及发酵周期过长的问题，对工业化生产丁醇有着重要意义。

（二）项目研究内容及实施方案

1.研究内容

本研究拟根据文献确定采用葡萄糖为碳源时培养基组成中影响丁醇产量的7-8个显著因素及PB试验中相应的低水平值，利用Plackett-Burman试验确定3-4个p值<0.1的最主要影响因素，再用最陡爬坡实验确定中心点，通过中心组合设计进一步优化试验并采用响应面分析法分析结果得出最优组合，通过验证以期使丁醇产量达到7g/L以上。本研究主要使用的实验设计及数据分析软件为Design-Expert8.0.6.1。

3

2.实施方案

⑴确定试验设计方案：

进行Plackett-burman（PB）实验：在研究微生物制丁醇的培养基条件优化时，影响因素往往种类繁多，且各组分间相互作用也错综复杂。因而，找到主要的影响因素就显得尤为重要。而Plackett-burman（PB）是基于非完全平衡块原理，它试图用最少的试验次数达到使因素的主效果得到尽可能准确的估计，适用于从众多考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素，供进一步研究。试验中每个因素取高低两个水平，低水平为原始培养条件，高水平约取低水平的1.25倍。对实验结果进行分析，得出各因素的可信度水平。一般选择可信度大于90％以上的因素作为重要因素[6]。

最陡爬坡试验：CCD试验得到的拟合方程只是能考察紧接邻域并将其充分近似的情形，在其他区域拟合方程与被近似的函数方程毫无相似之处。所以，只有先逼近最佳值区域才能建立有效的响应面拟合方程。按着Plackett-burman筛选出来的结果确定对象最陡爬坡法以响应值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素响应值的大小、正负确定步长与方向，能经济、快速的逼近最佳值区域，确定下一步的RSM中心点[7]。

Central Composite Design（CCD）试验：一般的试验设计与优化方法，都未能给出直观的图形，因而也不能凭直觉观察其最优化点，虽然能找出最优值，但难以直观地判别优化区域．为此响应面分析法（也称响应曲面法）应运而生。响应面分析也是一种最优化方法，运用图形技术将这种函数关系显示出来，以供我们凭借直觉的观察来选择试验设计中的最优化条件[8]。它有两种方法，一种为响应面分析法中的中心组合设计（CCD），另一种为Box-Benhnken(BB)实验。而CCD比BB实验能更好的拟合相应曲面。因为CCD的设计过程中，有很多点会超出原定的水平，CCD适用于多因素多水平实验，有连续变量存在；BBD适用于因素水平较少（因素一般少于5个，水平为3个）。所以用CCD可以有效并准确的在中心点附近确定各因素的五个不同水平并进行CCD实验设计，响应面分析确定最佳浓度组合并根据回归方程得到预期丁醇产量。

运用Design-Expert软件整合求解：Design-Expert软件是一个很方便的进行响应面优化分析的商业软件，在Design-Expert软件中，有一个专门的模块是针对响应曲面法（RSM）。其可以很好的进行二次多项式类的曲面分析，一些操作比另一种软件SAS更为方便，其三维做图的效果比SAS更为直观。响应面分析的优化结果，可以由软件自动获得，而无需将曲面方程使用MATLAB之类数学工具的进行求解。 ⑵确定影响因素

碳源：单一还原糖利用率最高的为葡萄糖，但考虑到工业上常以糖蜜、野生植物、淀粉质和纸浆废液为原料制丁醇[9]，木糖在木质纤维素资源水解产物中含量仅次于葡萄糖，又由于碳代谢抑制作用（CCR）的存在木糖的利用成为发酵过程中的限制因素[10]。但考虑到实验量本实验拟以葡萄糖为单一碳源进行实验[11]。

氮源：氮源分为蛋白质类和非蛋白质类，蛋白质类氮源大部分都是粉状或膏状物质会增加制备培养基和调节pH难度[12]，所以选择非蛋白质类氮源(NH4)2SO4。

无机盐：细菌生长繁殖需要多种无机盐离子，如Mg2+可作为己糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氢酶、核酸聚合酶的活性中心组分，同时可以维持细胞膜内外两侧的pH，减少高浓度丁醇对细胞的毒害作用；P元素可作为核酸、核蛋白、磷脂、辅酶及ATP等高等分子成分，同时HPO42--H2PO4-可作为缓冲系统调节培养基pH；K+会影响细胞膜两侧pH；Fe2+可控制细胞内氧化还原电位，并调节和维持细胞的渗透压平衡；当(NH4)2SO4位氮源时，由于NH4+被吸收，导致培养基pH下降，需要在培养基中加入CaCO3作为缓冲物质[13]。故本实验拟采用MgSO4·7H2O、K2HPO4·3H4O、FeSO4·7H2O和CaCO3作为无机盐类影响因素。

4