生长因子：生长因子是一些细菌生长所必须而自身不能合成的物质，通常为有机化合物，包括B族维生素、某些氨基酸、嘌呤及嘧啶等。少数细菌还需要特殊的生长因子，故常在培养基中加入动物血清、酵母浸液、肝浸液及鸡蛋等。丙酮丁醇梭菌以生物素和对氨基苯甲酸作为生长因子。本实验拟选择生物素和对氨基苯甲酸作为生长因子类影响因素。 ⑶确定实验条件及方法
菌种：ABE发酵工业菌种是梭状芽胞杆菌，近年来研究表明产溶剂梭菌归为4个种，一种是丙酮丁醇梭菌，以淀粉质为原料，主要发酵玉米和谷类等，其他3种是以糖为原料，它们是拜氏梭菌、糖丁酸梭菌和糖乙酸多丁醇梭菌[14]。目前生产用的菌种都是经过选育驯化得来的，提高了丁醇的比例，也提高了转化率，并且选育出适合废渣、废液等特定原料的菌种[15]。本实验采用实验室提供菌种拜氏梭菌F-6。
温度：最适培养温度37℃，最适发酵温度37℃，从总溶剂转化率综合考虑最适温度为37℃。 pH：菌体生长最适pH为5.5-7.0，发酵最适pH为5.0，当pH低于4.0或高于8.0时不利于发酵。发酵分成两个阶段，有产酸和产溶剂两步[16]。产酸期，发酵前期菌体快速生长，大量分解利用碳源，产生乙酸和丁酸，同时释放H2和CO2，发酵液的pH逐渐降低。菌体的生长速度减慢，开始进入稳定期。产溶剂期，发酵液的pH降低到4.3左右就不再下降而是逐渐上升，与此同时溶剂也开始积累，并且由产酸期向产溶剂期转变，然而这一转变机制尚未研究清楚。在这一阶段乙酸和丁酸不再大量积累而是被还原成ABE。若发酵过程中pH最低小于3.3就可能染菌或酸败[17]。综合考虑初始pH以7.0最佳[18]。
菌种活化及保藏：每次实验开始时活化一次，进行厌氧瓶发酵，菌种保藏将采用简单保藏，置于4-6摄氏度冰箱内保藏1～2个月。 发酵方式：批次发酵 接种量：1%
产物预处理：发酵液中杂质较多，在做气相色谱分析以前要进行预处理，以防色谱柱堵塞。发酵液12000r/min离心l0min，取上清液[19]。
检测方法和数据分析：使用气相色谱分析产物丁醇的浓度并采用外标法。使Design-Expert8.0软件处理实验数据。 ⑷实验流程
PB实验：根据培养基的组成选取碳源中的葡萄糖，氮源中的(NH4)2SO4，无机盐中的MgSO4·7H2O、K2HPO4·3H2O、FeSO4·7H2O和CaCO3，生长因子中的生物素和对氨基苯甲酸为初期影响因素并查阅相关文献确定每个影响因素的最适值，以此值作为PB实验的低水平值，1.5倍左右为高水平值进行PB实验，并设置两个虚拟变量以消除实验时其他因素带来的误差。根据实验结果得到关于产量的一次方程，确定3-4个主要影响因素；
最陡爬坡实验：根据具体情况确定爬坡实验的方向和步长，进行实验并根据结果确定RSM中心点；
CCD实验：在中心点附近确定各因素的五个不同水平并进行CCD实验设计，对得到的实验结果进行回归拟合得到关于产量的二次方程，通过响应面分析确定最佳浓度组合并根据方程得到预期丁醇产量。
检验实验：根据RSM试验结果进行三组平行实验，检测丁醇的平均浓度，与预期结果比较检验方程。
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（三）进度安排
1.查阅文献：2016年11月-2017年2月
2.学习基本操作：2016年11月下半月-2016年12月 3.进行前期实验：2017年3月
4.进行后期实验：2017年4月-2017年5月 5.项目总结与结题：2017年6月
（四）中期及结题预期目标
1.中期预期目标：
1) 查阅文献并设计实验熟悉实验流程并掌握实验操作 2) 学会使用Design-Expert8.0软件。 2.结题预期目标：
3) 通过培养基优化使丁醇产量达到7.0g/L以上，达到项目实验目的；
4) 通过年度项目使每个成员了解进行科学研究时的大致流程并具备一定的查找资料的能力，
全面提高本小组成员的科研素质； 5) 学会PB、CCD等实验设计方法，了解实验设计对实验的重要性，并学会一款专业实验设
计软件的使用。
（五）经费使用计划
1.资料费、打印费：200元 2.交通费：300元 3.耗材费：500元 总计：1000元
（六）主要参考文献
[1]申利英. 汽爆玉米秸秆发酵制取生物丁醇的试验研究[D].郑州大学,2012.
[2]葛慧,陆文钦,郭志强. 新型能源纤维素丁醇产业化发展现状及前景分析[J]. 中国生物工程杂志,2016,02:115-121.
[3]汪江林. 探析高产丁醇菌种的选育及代谢副产物对丁醇发酵的影响[J]. 科技与创新,2016,03:124.
[4]庞宗文,俸雪,吴三星,陆薇. 以新鲜马铃薯为原料发酵丙酮丁醇的研究[J]. 可再生能源,2012,11:83-86+92.
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