HPLC法测定apoA-1介导的泡沫细胞胆固醇流出的实验研究

HPLC法测定apoA-1介导的泡沫细胞胆固醇流出的实验

研究*

马卫列1，龚晓华1，李观强2，丁 航1，兰柳波1，陈小谊1，张志珍1△ 【摘 要】[摘要] 目的 建立用高效液相色谱(HPLC)法测定载脂蛋白A-1(apoA-1)介导的泡沫细胞内胆固醇流出率的实验方法。方法 人单核细胞THP-1用160 nmol/L佛波酯(PMA)诱导24 h分化为贴壁巨噬细胞(PMA组)，再用50 μg/mL乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)处理48 h，诱导巨噬细胞变成泡沫细胞(ac-LDL组)；加入含apoA-1的1640培养基培养24 h(apoA-1组)。油红O染色和HPLC法测定细胞内胆固醇水平，鉴定巨噬细胞源性泡沫细胞模型。采用HPLC分析和液体闪烁计数法测定apoA-1介导的泡沫细胞内胆固醇流出率。结果 THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞经油红O染色后，细胞内可明显观察到大量红色脂滴存在。胆固醇水平测定显示，ac-LDL组内游离胆固醇、总胆固醇和胆固醇酯的水平明显高于PMA组(P<0.01)。ac-LDL处理细胞48 h后，ac-LDL组内总胆固醇水平为80.25 μg/mg细胞蛋白，胆固醇酯水平为47.65 μg/mg细胞蛋白，占总胆固醇的59.38%，与PMA组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。HPLC分析和液体闪烁计数法结果表明，apoA-1介导泡沫细胞内apoA-1组胆固醇流出率分别为5.63%和7.08%(P<0.01)。结论 本研究成功建立了酶促反应结合HPLC测定泡沫细胞内胆固醇流出的方法，为后续研究细胞脂质代谢提供了实验基础。 【期刊名称】重庆医学 【年(卷),期】2015(000)029 【总页数】5

【关键词】[关键词] 色谱法，高效液相；泡沫细胞；载脂蛋白A-1；胆甾烯酮；胆固醇流出 ·技术与方法·

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是大多数心脑血管疾病发生的前期病理基础[1-2]，在AS发生、发展过程中，巨噬细胞来源的泡沫细胞(foam cells)形成是动脉粥样损伤形成的特征性改变，促进细胞内胆固醇和胆固醇酯的流出是调节巨噬细胞胆固醇动态平衡的关键环节，对减少细胞内胆固醇蓄积和AS防治意义重大[3]。一般细胞在摄取胆固醇时会启动胞内胆固醇的正常流出，而泡沫细胞则表现为胆固醇代谢失调，主要是由于细胞内胆固醇酯过度堆积和胆固醇流出受阻，使细胞内胆固醇酯水平占总胆固醇的50%以上[4]。高密度脂蛋白介导胆固醇从巨噬泡沫细胞流出是清除细胞内过量胆固醇的最主要途径[5-6]，胆固醇以囊泡分泌形式进行转运[7]，在此过程中有高密度载脂蛋白A-1(apolipoprotein A-1，apoA-1)的介导[8]。研究apoA-1所介导的泡沫细胞胆固醇流出的重要环节之一就是要准确测定细胞内各种胆固醇的水平以及胆固醇的流出率，为此，本文的目的就是采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法测定apoA-1介导的泡沫细胞内和培养基中的胆固醇水平，计算胆固醇流出率，从而建立一种非同位素的较准确测定泡沫细胞胆固醇流出率的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 人单核细胞THP-1购自湘雅医学院细胞中心；RPMI 1640培养基和胎牛血清(FBS)购自Gibco公司。

1.1.2 试剂 佛波酯(phorbol-1-myristate-13-acetate，PMA)购自Promega公司；乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low-density lipoprotein，ac-LDL)购自Biochemical Techologies公司；[3H]-胆固醇购自PerkinElmer公司；胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、胆甾烯酮标准品、apoA-1和油红O染料购自Sigma公司；TritonX-100购自上海生工公司；HPLC级甲醇购自天津大茂公司；BCA试剂盒购自碧云天生物科技公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。 1.1.3 主要仪器 1200型高效液相色谱仪(Agilent公司)；液体闪烁计数仪(PerkinElmer公司)；CO2细胞培养箱和生物安全柜(NUAIRE公司)；TS100倒置相差显微镜(Nikon公司)；5417R型高速台式离心机(Eppendorf公司)；多功能酶标仪(基因有限公司)。 1.2 方法

1.2.1 巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立 THP-1细胞悬浮培养于含10% FBS的RPMI 1640培养基中，2～3 d传代1次，3～5代后可用于建立巨噬细胞源性泡沫细胞。THP-1细胞传代至6孔板(1×106个/孔)，加入PMA至终浓度160 nmol/L，37 ℃、5% CO2培养24 h，使悬浮细胞分化为贴壁巨噬细胞。更换培养基，加入ac-LDL至终浓度50 μg/mL，继续孵育48 h，诱导贴壁巨噬细胞分化为泡沫细胞。同时设PMA对照组，每组设3个重复孔。

1.2.2 油红O染色观察巨噬细胞源性泡沫细胞 吸去6孔板中培养基，PBS漂洗3次。泡沫细胞用预冷的4%多聚甲醛固定10 min；PBS洗1次，加入50%异丙醇作用5 min；吸去异丙醇，加入0.5%油红O室温染色15 min。60%异丙醇漂洗3～5次，苏木素染色4 min，自来水冲洗反蓝；PBS漂洗1次，置倒置相差显微镜下观察。