基于网络药理学探讨参芪地黄汤防治糖尿病肾脏病作用机制-吴琪琪 - 图文

第23卷 第2期 2021 年 2 月

JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM

辽宁中医药大学学报

Vol. 23 No. 2 Feb .，2021

DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2021.02.011

基于网络药理学探讨参芪地黄汤防治

糖尿病肾脏病作用机制

吴琪琪，佟奕霖，王诗怡，杨宇峰，石岩

（辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847）

摘要：目的 运用计算机网络药理学方法预测参芪地黄汤（Shengqi Dihuangtang，SDT）防治糖尿病肾脏病

（Diabetic kidney disease，DKD）的作用靶点和信号通路，进一步分析其防治DKD的基础和作用机制。方法 通过中药系统药理学分析平台（TCMSP）采集SDT全方7味中药的有效成分及作用靶标基因；从Gene Cards数据库搜集DKD的靶标基因，将二者取交集获得药物-疾病靶基因并且绘制相关维恩（Venn）图；使用 Cytoscape 3.6.1软件构建药物-相关疾病-潜在活性成分-关键靶点网络；从String数据库构建靶点蛋白互作（PPI）网络；分别进行关键靶点基因本体（GO）分析和基因相互作用（KEGG）通路分析。结果 获得105个活性化合物，药物靶点114个，疾病靶点10 517个，交集靶点109个。关键活性成分主要包括槲皮素（Quercetin）、木犀草素（Luteolin）、异鼠李素（Isorhamnetin）、山柰酚（Kaempferol）。PPI网络关键靶点包括白细胞介素-6（IL-6）、CASP3、血管内皮生长因子（VEGFA）、表皮生长因子受体（EGFR）等。GO分析得出117个功能条目；KEGG富集分析得到113条通路，其中PI3K-Akt信号通路可能是该方发挥作用的主要信号通路。结论 该研究初步预测SDT可能通过靶向作用关键蛋白和重要通路从而达到防治DKD的目的，并有望对中药复方防治DKD提供新的证据和研究思路。

关键词：参芪地黄汤；糖尿病肾脏病；网络药理学；消渴

(2021) 02- 中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1673-842X 0041- 07

Mechanism of Shenqi Dihuang Tang（参芪地黄汤）in Preventing Diabetic Kidney Disease Based on Network PharmacologyWU Qiqi，TONG Yilin，WANG Shiyi，YANG Yufeng，SHI Yan（Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，Liaoning，China）Abstract：Objective To predict the target and signal pathway of Shenqi Dihuang Tang（参芪地黄汤，SDT）in the prevention and treatment of diabetic kidney disease（DKD）by using computer pharmacology method，and to further analyze the basis and mechanism of its prevention and treatment of DKD. Methods The effective components and target genes of 7 herbs of SDT were collected with the help of TCMSP. Target genes of DKD were collected from the Gene Cards database，and the two were intersected to obtain drug-disease protein target genes and draw Venn diagram. Using Cytoscape 3.6.1 software to construct drug-disease-active component-key target network；From the String database build target protein interactions（PPI）networks；Gene Ontology（GO）analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）pathway enrichment analysis were performed. Results 105 active compounds，114 drug targets，10 517 disease targets and 109 intersection targets were obtained. The key active ingredients include quercetin，kaempferol，luteolin and isorhamnetin. Key targets of PPI network include interleukin-6（IL-6），Caspase3（CASP3），vascular endothelial growth factor （VEGFA），epidermal growth factor receptor （EGFR），etc. GO function analysis results in 117 function items；According to KEGG enrichment analysis，113 pathways were identified，among which the PI3K-Akt signaling pathway may be the main signaling pathway in which this pathway plays a role. Conclusion This study preliminarily predicted that SDT could prevent and treat DKD by targeting key proteins and important pathways，which is expected to provide new evidence and research ideas for the prevention and treatment of DKD by TCM compound.Keywords：Shenqi Dihuang Tang（参芪地黄汤）；diabetic kidney disease；network pharmacology；Xiaoke糖尿病肾脏病（Diabetic kidney disease，DKD）在过去也被称为糖尿病肾病（Diabetic nephropathy，DN）。但在2007年，美国肾脏病与透析病人生存质量指导指南（KDOQI）提出使用新的医学术语：糖尿[1]病肾脏病（DKD）。DKD是一种糖尿病微血管并发症，是由于糖尿病引起的肾脏损害，并且目前在全世界范围内已经成为导致终末期肾衰的首要原因[2]。DKD的临床综合征包括持续蛋白尿、肾小球滤过率基金项目：国家重点基础研究发展计划（973计划）（2013CB532004）

作者简介：吴琪琪（1996-），女，浙江温州人，硕士研究生，研究方向：中医内科学内分泌疾病。通讯作者：石岩（1963-），男，辽宁沈阳人，教授，博士研究生导师，博士，研究方向：中医内科学临床与科研。

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（GFR）持续下降、血压升高、心血管事件增加及其相关病死率增加，与此同时糖尿病透析患者的病死率也比非糖尿病透析患者的病死率高[3]。根据2014年度中华糖尿病学会调查结果显示：我国院内DKD的患病率已经高达40%[4]。本病属于中医疾病范畴里的“水肿、虚劳、关格”等，中医古籍对DKD的症状和病因病机也早有记载。北宋·赵佶《圣济总录》记载：“消肾，小便白浊如凝脂，形体羸瘦”，第一次提出了“消肾”的概念；明·戴原礼《证治要诀》有言：“三消久而小便不臭，反作甜气，在溺中滚涌，更有浮溺，面如猪脂，此精不禁，真元竭也”，当消渴病合并有“尿浊”证候即为“真元竭”，预后不佳[5]。参芪地黄汤（Shengqi Dihuang Tang，SDT）最初见于清·沈金鳌《沈氏尊生书卷三·杂病源流犀烛·大肠病源流》，方药由熟地黄、山药、黄芪、党参、山萸肉、牡丹皮、茯苓7味中药组成，是治疗肠痈气血大虚“溃后疼痛过甚，淋沥不已”的峻补之剂，后人将此方药灵活变换应用于多种疾病[6]。2011年中华中医药学会糖尿病肾病中医防治指南中指出糖尿病肾病中气阴两虚证应以益气养阴为治法，方药采用参芪地黄汤（《沈氏尊生书》）加减，由地黄、山药、党参、黄芪、茯苓、山茱萸、牡丹皮组成[7]。王静[8]研究表明加味SDT能够下调尿中非酶糖基化终产物（AGEs）和蛋白激酶C（PKC）表达水平；改善早期DKD气阴两虚兼血瘀证患者的临床证候；能够减少蛋白尿，改善肾功能，调节糖脂代谢等。长期以来的临床疗效和前期实验研究表明，SDT对防治DKD具有一定的疗效，但历年来一直缺乏系统完善的研究。对此，本文采用近年来迅速发展的网络药理学方法并结合可视化技术，根据中药复方治疗疾病具有多途径、多靶点与多靶点协同作用的特点，从而对SDT治疗DKD的主要活性成分、作用靶点和通路等方面进行深入探讨，以求更为全面地了解SDT的作用机制，为接下来的临床应用以及实验研究提供更为全面的参考依据。1?材料与方法1.1 化学成分及作用靶点构建 借助中药系统药理学数据库（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）检索组成SDT的7种中药包括党参、黄芪、熟地黄、茯苓、山药、山茱萸、牡丹皮中的化学成分。以类药性（DL）≥0.18和口服生物利用度（OB）≥30%作为评价标准，以此为条件筛选活性成分，筛选出党参、黄芪、熟地黄、茯苓、山药、山茱萸、牡丹皮中的化合物及其对应靶点，并通过Uniprot数据库（http：//www.uniprot.org/）把所筛选出的靶点转换成相对应的基因。1.2 DKD相关靶点获取以“Diabetic kidney disease”为关键词在Gene Cards数据库（https：//www.genecards.org/）检索该疾病的相关靶点，将检索出的靶点进行整合，去掉重复值，构建DKD的相关靶点的疾病数据库。1.3 “SDT-DKD-潜在活性成分-关键靶点”的网络构建与分析将SDT中的潜在活性成分所对应的靶点基因和42

DKD相关的靶点基因利用R语言进行配对，从而获得SDT-DKD的关键靶点即两者的交集基因，并根据交集基因绘制对应的维恩（Venn）图。“SDT-DKD-潜在活性成分-关键靶点”的关系网络由Cytoscape软件（3.6.1）构建。通过该网络探究SDT改善DKD的作用机制。1.4 蛋白互作（PPI）网络的构建 在String数据库平台（https：//string-db.org/）导入SDT-DKD关键靶点并进行PPI分析，设置最低相互作用评分为中等置信度[“medium confidence（0.400）”]，研究物种限定为“人”（“Homo sapiens”），将网络中无联系的节点隐藏，其余参数保持默认设置，从而得到SDT作用于DKD的PPI网络。网络图中浅蓝线和紫色线分别代表从数据库中得来的蛋白间相互作用和已经经过实验验证的蛋白间相互作用。1.5 关键靶点基因本体（GO）分析和基因相互作用通路分析为了进一步说明中药化合物对应的预测靶点在基因功能和通路中的作用，利用Bioconductor平台//bioconductor.org/biocLite.R）、R语言对获得的关键靶点基因依次进行GO分析和KEGG分析，导出GO富集分析表格及KEGG富集分析表格、通路图，并绘制barplot柱状图和dotplot点图。2?结果2.1 SDT活性成分的筛选 借助TCMSP数据库检索SDT中7种中药党参、黄芪、熟地黄、茯苓、山药、山茱萸、牡丹皮中所有化学成分，以化合物的口服利用度OB≥30%，类药性DL≥0.18为筛选阈值共搜集了105个化合物，其中党参21个、黄芪20个、熟地黄2个、茯苓15个、山药16个、山茱萸20个、牡丹皮11 个。2.2 SDT成分改善DKD的潜在作用靶点预测 通过TCMSP数据库将2.1检索得到的105个小分子化合物依次作为关键词进行查询，以Targets Information为查询结果，继而得到各个化合物所对应的靶标蛋白信息，发现这105个小分子化合物的潜在活性成分作用靶点共571个，其中黄芪潜在活性成分的作用靶点209个，党参潜在活性成分的作用靶点94个，熟地黄潜在活性成分的作用靶点16个，茯苓潜在活性成分的作用靶点15个，山药潜在活性成分的作用靶点61个，山茱萸潜在活性成分的作用靶点56个，牡丹皮潜在活性成分的作用靶点120个，去除重复作用靶点后，共计得到114个作用靶点。以“Diabetic kidney disease”为关键词在Gene Cards数据库中进行检索，将检索得到的疾病靶点去掉重复值并进行整合，共计得到靶点10 517个。通过R语言绘制Venn图，获得交集靶点109个，结果见图1。2.3 “SDT-DKD-潜在活性成分-关键靶点”的网络构建与分析通过Cytoscape3.6.1软件对SDT-DKD-潜在活性成分-关键靶点关系数据进行网络的构建，得到了一个包含176个节点（59个活性成分节点、109个靶点节点、7个单味药节点和1个疾病名称节点，其（KEGG）（http： 23卷 辽宁中医药大学学报 中46个活性成分没有与靶点直接相连）和573条连线的网络（各条连线分别表示疾病与靶点、单味药与活性成分、活性成分与靶点之间的联系），其中粉色节点代表疾病，蓝色节点代表疾病与药物活性成分的关键靶点；黄色节点为SDT中的7味药物，橙色节点为SDT中与关键靶点相关的活性成分，每个节点的度值代表和此节点相连接的边的条数，见图2。以 Degree值作为拓扑分析的主要参考依据，排名前四的活性成分依次是槲皮素（Quercetin）、山柰酚（Kaempferol）、木犀草素（Luteolin）、异鼠李素（Isorhamnetin），分别能与78、35、28、18个靶点对接，详见表1。这些度值较高的化合物可能是SDT发挥治疗DKD的关键化合物。度值前六的靶点为NCOA2、PTGS1、PGR、PRSS1、CHRM1、PPARG，其Degree值分别为35、25、21、19、15、15。这体现了中药方剂多成分、多靶点的作用机制。图2 SDT-DKD-潜在活性成分-关键靶点网络2.4 PPI网络的构建及分析 图1 SDT-DKD靶点基因为了更进一步研究SDT防治DKD的作用机制，本研究将SDT-DKD的109个关键靶点导入String数据库平台（https：//string-db.org/）预测蛋白相互作用关系并绘制蛋白关系网络图，设置最低相互作用评分为中等置信度[“medium confidence（0.400）”]，研究物种限定为“人”（“Homo sapiens”），将网络中无联系的节点隐藏，其余参数保持默认设置，得到SDT作用于DKD的PPI网络，见图3。如图3所示，SDT靶蛋白PPI网络有1012条相互作用连线，其中网络图中浅蓝线和紫色线分别代表从数据库中得来的蛋白间相互作用和已经经过实验验证的蛋白间相互作用；有106个节点（有3个靶蛋白未参与蛋白间的相互作用），根据网络间连线节点数目排列，得到PPI网络中核心基因白细胞介素-6（IL-6）、CASP3（CASP3）、血管内皮生长因子（VEGFA）、表皮生长因子受体（EGFR）、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）等，见图4、表2。表1 关键活性成分的基本信息分子式结构活性成分Degree值槲皮素（Quercetin）78C15H10O7山柰酚（Kaempfero）35C15H10O6木犀草素（Luteolin）28C15H10O6异鼠李素（Isorhamnetin）18C16H12O743

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图3 SDT-DKD的蛋白关系网络图表2 关键靶点基本信息编号P05231P42574P15692P00533P45983靶基因IL-6CASP3VEGFAEGFRMAPK8靶蛋白白细胞介素-6（Interleukin-6）CASP3（Caspase 3）度值6156血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth 56Factor）表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor 55Receptor）丝裂原活化蛋白激酶8（Mitogen-activated Pro-55tein Kinase 8）2.5 GO富集分析图4 SDT-DKD的PPI网络核心基因GO富集分析结果显示，SDT-DKD的109个潜在关键靶点基因影响了117个生物学过程。GO富集排名靠前的生物学功能主要为DNA结合转录激活活性RNA聚合酶II特异性（16个靶点PGR/AR/ESR1/RELA/RXRB/NR1I3/FOS/TP63/ELK1/HIF1A/MYC/NFE2L2/PARP1/RUNΧ2/IRF1/NR3C1）、泛素样蛋白连接酶结合（12个靶点GSK3B/RELA/BCL2/EGFR/RB1/NFKBIA/CASP8/HIF1A/CCNB1/CHEK2/ERBB3/MDM2）、泛素蛋白连接酶结合（11个靶点GSK3B/RELA/BCL2/EGFR/RB1/NFKBIA/CASP8/44

23卷 辽宁中医药大学学报 HIF1A/CHEK2/ERBB3/MDM2）、类固醇激素受体活性（9个靶点PGR/AR/ESR2/ESR1/PPARG/RXRB/NR1I3/NR3C2/NR3C1）、转录因子活性直接的配体调节序列特异性DNA结合（9个靶点PGR/AR/ESR2/ESR1/PPARG/RXRB/AHR/NR1I3/NR3C1）、核受体活性（9个靶点PGR/AR/ESR2/ESR1/PPARG/RXRB/AHR/NR1I3/NR3C1）等，见图5、图6。图5 SDT-DKD的GO富集分析barplot图图6 SDT-DKD的GO富集分析dotplot图2.6 KEGG富集通路分析对SDT治疗DKD的109个关键靶点基因进行KEGG通路富集分析，共得到113条通路，根据基因数排序（Gene Count），排前5位的通路见表3，分析结果见图7、图8。结果显示关键靶点主要富集于糖尿病并发症中的PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、人巨细胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、乙肝（Hepatitis B）、癌症中蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer）等相关通路，图9为PI3K-Akt信号通路。综上提示SDT是通过多条信号通路来发挥治疗DKD的作用的。3?讨论中药复方是根据药量、药性、配伍关系等组成的中药处方，以辨证论治为指导思想，以整体观念为理论基础，同时中药复方具有多成分、多途径、多靶点的特点；现如今计算生物学、多向药理学、系统生物学等多学科技术发展迅速，从系统、整体角度研究药物机制的网络药理学是近年来一种新的研究方法，与中药复方基本特点相吻合[9]。表3 SDT-DKD的KEGG通路富集分析编号通路富集基因基因计数hsa04151PI3K-Akt signal-CHRM1/CHRM2/GSK3B/RELA/IKBKB/21ing pathwayBCL2/EGFR/VEGFA/CCND1/CASP9/IL6/RAF1/PRKCA/ERBB2/MYC/NOS3/IGF2/ERBB3/MDM2/MCL1/MTORhsa05163Human cytomeg-GSK3B/RELA/IKBKB/CASP3/EGFR/VEGFA/19alovirus infectionCCND1/CASP9/RB1/IL6/ELK1/NFKBIA/CASP8/RAF1/PRKCA/MYC/PTGER3/MDM2/MTORhsa05167Kaposi sarcoma-GSK3B/RELA/IKBKB/CASP3/MAPK8/18associated her-ICAM1/VEGFA/CCND1/FOS/CASP9/RB1/pesvirus infectionIL6/NFKBIA/CASP8/RAF1/HIF1A/MYC/MTORhsa05161Hepatitis BRELA/IKBKB/BCL2/CASP3/MAPK8/FOS/17CASP9/RB1/IL6/ELK1/NFKBIA/CASP8/RAF1/PRKCA/MYC/BIRC5/PCNAhsa05205Proteoglycans in ESR1/CASP3/EGFR/VEGFA/CCND1/PLAU/17cancerELK1/RAF1/PRKCA/HIF1A/ERBB2/CAV1/MYC/IGF2/ERBB3/MDM2/MTOR图7 SDT-DKD的KEGG 通路富集分析barplot图图8 SDT-DKD的KEGG 通路富集分析dotplot图45