蛋白免疫印迹杂交（Western Blot, WB）
WB是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB 是进行微量蛋白质分析比较成熟的技术之一。以下是总结Western Blot 操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。
A第一部分：蛋白样本提取制备
蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：
1. 尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提
取方法或选择不同的试剂盒产品）；
2. 保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、表面活性剂、还原剂
等的选择）；
3. 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋
白酶和磷酸酶抑制剂）；
4. 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策
略）；
5. 样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。
方法的选择
? 自行配制抽提试剂，根据文献方法或经验提取 ； ? 购买商品化试剂盒，按其说明书的方法提取 。
Example 1：
实验中提取肾脏总蛋白，具体实验过程如下：
1. 提前一天4℃解冻RIPA，一定要完全融化；配PBS（用于细胞试验则需高压）； 2. 配制裂解液：PMSF:RIPA=1:99,PMSF终浓度为100mM（根据样本数配制所需
的量，临用临配）；
3. 裂解组织：每个样品称取100mg，加1ml裂解液，匀浆后4℃静置2h使其充分
裂解，14000g，4℃离心10min，取上清。
4. 蛋白定量：取少量上清稀释30倍蛋白定量，然后计算出各样本原液蛋白浓度。
注意由于裂解液里含有较高浓度的洗涤剂，蛋白定量不能选用Bradford法，可以选用改良的Lowry’s法或者BCA法。
5. 样品蛋白浓度均一化：根据蛋白定量计算的结果将各样品蛋白浓度调整一致。
具体方法为加入PBS稀释至样品浓度一致，本次蛋白浓度为3mg/ml。 6. 分装并存于-80℃，避免反复冻融。
B 第二部分：
相关试剂的配制：
1. 10%的SDS（戴口罩称取）：
称取SDS10g，先加双蒸水80ml，再用磁力加热搅拌助溶，然后定容至100ml。室温保存，如在长期保存中出现沉淀，可在50℃水浴溶化后，仍可使用。 2. 1.5M Tris/HCL（pH8.8）
Trisbase 18.17g，溶解于80ml双蒸水，用浓盐酸调pH至8.8，最后定容至100ml，室温下保存。
3. 0.5M Tris/HCL（pH6.8）
Trisbase 6.06g，溶解于80ml双蒸水，用浓盐酸调pH至6.8，最后定容至100ml，室温下保存。
4. 30%丙烯酰胺/0.8%N,N’-亚甲丙烯酰胺 丙烯酰胺（Acr） 75g 甲叉双丙烯酰胺
2g
加双蒸水150ml，37℃加热溶解后，定容至250ml，查证该溶液pH应不大于7.0，4℃棕色瓶保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
Be careful!!!：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和口罩。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。 5. 上样缓冲液 0.5mM Trisbase(pH6.8)
甘油 10％SDS
2.5ml 2.0ml 4.0ml
0.4%溴酚蓝（mw669.97） 1ml 二巯基乙醇（mw78.14） 0.5ml 注：配好后分装-20℃保存。 6. 电泳缓冲液
Trisbase 甘氨酸 SDS
10倍储存液
30g 144g 10g
1倍应用液
3g 14.4g 1g
加水至1000ml，PH值用HCl调8.3。已经配制了1000ml的储存液。电泳缓冲
液用应老师的电泳槽应用液300ml。用10倍的储存液30ml加入水270ml。 7. 转移缓冲液（临用临配，铁盒子里搅拌混匀并4℃预冷）： Tris base 0.606g 2.424g
甘氨酸 2.88g 11.52g
H2O（ml）
160 640
甲醇（ml）
40 160
终体积（ml）
200 800
2板胶转移缓冲液的用量约为200ml。 8. 洗涤缓冲液（TBS）
Tris base NaCl
10倍储存液 1倍应用液 24.2g 80g
2.42g 8g
加水800ml，用HCL调整PH为7.6，再加水至1000ml，已经配制了1000ml的TBS液，临用时再加0.1%的Tween-20。一般做两板胶要用洗涤缓冲液500ml；用储存液50ml加入450ml水，后加0.5ml Tween-20。 9. 封闭缓冲液（5%脱脂奶粉）—10ml/膜
脱脂奶粉
2g
洗涤缓冲液 40ml
两板胶4张膜要用封闭缓冲液40ml。
具体实验步骤： 准备：
准备器材：10%过硫酸铵；冰盒；预热恒温加热器；拿出试剂（双丙和TEMED提前从冰箱拿出平衡，否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡）；电泳仪器；洗干净的板子和梳子；滤纸条用于吸水；剪刀；尺子；
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