3.2.3 PCR实验操作流程

中南大学《临床科研实验技能》MOOC-PCR实验操作流程

PCR实验操作流程

PCR实验操作必须在无菌条件下进行，以确保实验的稳定性。

首先我们需清洁实验操作台。用75%酒精擦洗超净工作台，关上超净工作台，关上电灯，紫外灯照射半小时。

书写实验记录，主要记录实验日期、所用试剂和具体用量、PCR条件设定、使用DNA样本（模板）分子号和所用引物名称等。（提前记录好，后续实验步骤可按照实验记录进行）

我们取出PCR所用试剂，有10×Taq Buffer、dNTPs、MgCl2溶液、Taq DNA聚合酶（保存在冰箱或冰盒中，随取随用）、PCR引物、gDNA模板和PCR实验用水。

把PCR所用试剂按说明书实验剂量（以Thermo SCIENTIFIC Taq DNA Polymerase 50 μL反应体系为例）加入200 μL EP管中。

首先加入33.75 μL PCR实验用水(Nuclease-free water)，然后分别按量加入5 μL 10×Taq Buffer，3 μL浓度为25 mM MgCl2溶液，5 μL浓度为2 mM dNTP混合液（dNTP Mix），1 μL正向引物和1 μL反向引物（10 μM），1 μL gDNA模板（10 pg~1 μg），最后在冰盒里取出0.25 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL）加入，混匀。 以上步骤可以按一定比例预先配好（例如，当使用不同gDNA模板和引物时，可按比例将PCR实验用水、10×Taq Buffer、MgCl2溶液和dNTP Mix预先配好，再按比例吸取一定量混合液加入对应EP管中，混匀）。

将已按说明书要求加完PCR实验试剂的EP管依次放入PCR扩增仪中。 设置PCR实验条件，如预变性95℃3 min，变性95℃30 s，退火60℃30 s，延伸72℃1 min，变性-退火-延伸35个循环，最后延伸72℃5 min，4℃维持。以上退火温度（Tm-5）和延伸时间（1 min/kb）依据扩增模板等要求进行调整。 待PCR结束后，关闭PCR扩增仪。取出PCR产物准备检测。

中南大学《临床科研实验技能》MOOC 主讲人：邓昊 教授