NaCl 10g（高盐）或5g（低盐）
氨苄青霉素（Ampicillin） 100mg/ml
在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。待冷却至55℃，向溶液中加入1.5ml 100mg/ml 的氨苄青霉素。然后贮存于4℃备用。
LB平板培养基：
胰蛋白胨 10g
酵母粉 5g
NaCl 10g或5g ，
琼脂 13g
在三角瓶中依次将上述配方加入1L的重蒸水中并高压灭菌。待培养基降温至50℃，取出培养基并轻轻旋转以使溶解的琼脂均匀分布于整个培养基溶液中，根据需要加入氨苄青霉素，然后可直接从三角瓶中倒出培养基铺制平板。90mm直径的培养皿约需30～50ml培养基。培养基完全凝结后，倒置平皿并贮存于4℃备用。
其它试剂： 0.1M CaCl2溶液、灭菌蒸馏水
三、操作步骤
1. 感受态细菌的制备：
（1）用接种环从E.coli JM109菌平板上挑取一单克隆菌落，接种于装有5ml LB液体培养基的试管中中，37℃ 220 rpm振荡培养过夜（12～16h）。
（2）取0.5 ml过夜菌液接种到装有50ml LB液体培养基三角瓶中中，37℃，220 rpm振荡培养2－3h，隔20－30min测量OD600值，至OD600值为0.3-0.4。无菌条件下将细菌转至1.5ml 离心管中，每管1ml菌液，按需要决定管数。
（3） 4℃，12000 rpm，离心2 min，以回收细菌。
（4）倒净上清液，倒置离心管于滤纸上1min，使残留的痕量培养液流尽。每管加1ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细胞，冰浴30 min 。
（5）4℃，12000 rpm，2 min。
（6）倒净上清液，倒置离心管1min，使残留液流尽。每管加100 ul冰预冷的0.1 mol/L
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CaCl2重新悬浮细胞（重悬时操作要轻），即成感受态细胞悬浮液。
2.细菌转化：
（1）取3只灭菌的Ep管，分别编号1、2、3、分别加入以下各组分：加入10～20ng质粒DNA（体积小于10ul），同时做两个对照组：
1号：受体菌对照组： 100ul感受态细胞悬浮液+2ul无菌ddH2O
2号：质粒DNA对照组：100ul 0.1mol/L CaCl2+2ul pUC19
3号：正常转化组：100ul感受态细胞悬浮液+2ul pUC19
（2）轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min，促进DNA分子在感受态细胞表面的吸附。
（3）转入42℃水浴2min，通过热刺激增强CaCL2的作用，使细胞膜产生通道，便于DNA分子的吸附进入，提高转化率。
（4）迅速转入冰上冷却2min，修复细胞膜。
（5）加600u无抗生素lLB液体培养基，摇匀后于37℃，220 rpm，振荡60min。使受体菌恢复正常生长状态，并且表达Ampicillin抗性基因。
（6）取200ul菌液涂在含Ampicillin的LB平板，将平板置于无菌台直至液体被吸收，37℃恒温培养箱倒置培养12－16h后观察结果，其余保存于4℃。如果平板上没有长出菌落，可将之置于37℃恒温培养箱继续培养，同时将剩下的500ul菌液离心，倒掉大部分上清，留100ul左右，用移液器吹打重悬，再全部涂于含Ampicillin的LB平板上，置37℃培养。
（7）观察并记录转化子出现的数目，计算转化率。
四、注意事项：
1. 实验中所用的器皿均要灭菌，以防止杂菌和外源DNA的污染。
2. 实验过程中要注意无菌操作，溶液移取、分装等均应在无菌超净工作台上进行。
3. 必须设对照组，以检验实验过程中是否有污染。
4. 整个实验过程均需置于冰上。
5. 选用对数生长期细胞，OD600不应高于0.6。
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实验六 动物组织细胞基因组 DNA提取
一、实验原理
真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组 DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的 活性；而蛋白酶K可将 蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。
二、仪器及试剂
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1. 仪器：
恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）
2. 试剂：
（1）细胞裂解缓冲液：
Tris (pH8.0) 100 mmol/L
EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L
NaCL 20 mmol/L
SDS 10%
胰RNA酶 20ug/ml
（2） 蛋白酶K： 称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。
（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。
（4）酚?氯仿?异戊醇（25:24:1）、
（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。
三、操作步骤
1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。
2.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）
3.加等量的酚?氯仿?异戊醇振荡混匀，离心12000 rpm，5min。
4.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿?异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。
5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。
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6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。
7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。
8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。
9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。
10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。
四、常见问题
1.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。
2.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。
3. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。
4. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。
5.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤2～8。
6.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量。
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