基因克隆方法步骤

克隆步骤

一、 目的片段的回收纯化

1． 柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500ul

平衡液BL,12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）。

2． 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）

放入干净的离心管中，称取重量。

3． 向胶块中加入加入溶液PC(0.1g加入100ul，注意没过胶块)，50℃水

浴放置10min左右，期间不断温和地上下翻转离心管，已确保胶块充分溶解。

4． 将上一步所得溶液加入一个吸附柱（吸附柱放入收集管中），

12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

5． 向吸附柱CB2中加入600ul漂洗液（使用前请先检查是否已加入无

水乙醇），12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

6． 重复步骤5.

7． 将吸附柱CB2放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗

液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。

8． 将吸附柱CB2放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置

悬空滴加40ul的无菌水。室温放置2min，12000rpm离心2min，收集DNA溶液。(可以将离心后的溶液重新加到柱子中再回收一次)

9． 取2ulDNA加入 loading buffer点样，电泳检测是否回收出来样品。 二、 目的片段与载体的连接

1. 将回收的目的片段与T 载体连接，反应体系如下： 目的片段

pMD19-T simple Vector SolutionⅠ Total

1 / 3

4 .5μL 0.5μL 5 μL 10 μL

按上述体系依次加入各组分后，旋涡混匀，稍加离心后置于16℃连接过夜。 2.转化

1) 从-80 ℃冰箱中取 50 μL 感受态细胞在冰上解冻。

2) 在超净工作台上，加入10 μL 连接产物，轻轻混匀，冰上放置

30 min 。

3) 在42℃热击90s，然后迅速置于冰上5 min。

4) 加入700-1000 μL LB 液体培养基，37℃，低转速（150r/min）

振荡培养1h。

5) 取200 μL 菌液涂布于LB/Amp/X-Gal/IPTG 平板，37℃培养

12-16h （用AMP平板即可）。

6) 在超净台上挑取白色菌落加到含有1mlLB培养基和1ulAmp的

EP管中，摇菌培养。（挑单菌落切记一管一菌落，不可多加）

三、阳性克隆鉴定 反应体系为： 菌液 2ul 10x buffer 3ul 2.5x dNTP 2.4ul M13引物 前后各1ul 2.5U Tag聚合酶 0.4ul ddH20 18.4ul

Mg2+ 1.8ul 共30ul

按上述体系加入各组分后混匀，用牙签挑取单菌落作为模板，PCR 反应条件为：

94℃ 5min 95℃ 50s

56℃ 50s 30 cycles 72℃ 1min 72℃ 10min

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反应结束后取5μL PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，如能够扩增出约1500bp片段，将菌液送公司测序。 注：培养基配置 LB培养基

1. 称取Tryptone 10g、Yeast Extract 5g、Nacl 10g至于1L烧杯中。 2. 加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 滴加5N NaOH(约0.2ml),调节pH至7.0。 4. 加去离子水将培养基定容至1L. 5. 高温高压灭菌后，4℃保存。 LB/Amp 培养基

1. 称取Tryptone 10g、Yeast Extract 5g、Nacl 10g至于1L烧杯中。 2. 加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 滴加5N NaOH(约0.2ml),调节pH至7.0。 4. 加去离子水将培养基定容至1L. 5. 高温高压灭菌后，冷却至室温。 6. 加入1mlAmp（100mg/ml）后混合均匀。 7. 4℃保存。 100mg/ml Amp

1. 称量5gAmp置于50ml离心管中。

2. 加入40ml灭菌水，充分溶解后，定容至50ml。 3. 用0.22um滤器过滤除菌。

4. 小份分装后（1ml一份）后，-20℃保存。

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