天津科技大学硕士学位论文
(a) (b)
图3-16 G418抗性基因丢失菌株的点种反选 Fig.3-16 Counter selection for mutants with KanMX losing (a)：YEPD平板；(b)：G418(600 μg/mL)抗性YEPD平板
3.3.5.2 KanMX基因去除突变株的PCR验证
随机筛选在无G418平板上可以生长但在含有G418平板上不能生长的酵母突变株，命名为RY1-2。提取突变株RY1-1和RY1-2的基因组，并以此基因组为模板，利用引物Kan-U和Kan-D进行PCR扩增，突变株RY1-1和RY1-2应分别扩增出1610 bp与100 bp左右大小片段。经琼脂糖凝胶电泳（图3-17，泳道1和2）与预期大小一致，进一步证明突变株RY1-2基因组上的KanMX抗性基因已被成功剔除。
图3-17 KanMX基因丢失PCR验证 Fig.3-17 PCR identification for KanMX losing M： DL5000 DNA Marker；2：RY1-1；3：RY1-2
为了保证突变株RY1-2的遗传稳定性，需丢失其导入的pGAPza质粒。将突变株RY1-2于YEPD液体培养基中传代培养，传代十次后，选取RY1-2第一代及第十代提
43
3 结果与讨论
取酵母质粒，然后以提取的酵母质粒作为模板，利用引物Zeocin-up与Zeocin-down进行PCR扩增，验证pGAPza质粒是否丢失。由图3-18可知从第一代RY1-2酵母质粒上可扩增出1200 bp左右大小的Zeocin抗性基因片段，而从第十代RY1-2酵母质粒上则扩增不出，证明RY1-2突变株中的pGAPza质粒已丢失。
图3-18 pGAPza质粒丢失PCR验证 Fig.3-18 PCR identification for pGAPza losing M：DL5000 DNA Marker；2：第一代； 3：第十代
经黄酒发酵验证，突变株RY1-2的基本发酵性能和产高级醇含量与突变株RY1-1相比基本保持不变。
3.3.6 小结与讨论
将HOM2基因一个等位基因敲除的突变株RY1-1与出发菌株RY1进行黄酒发酵实验，发酵结果表明，与出发菌株相比，突变株RY1-1的基本发酵性能无明显变化，保持了黄酒酵母快速发酵的优良发酵特性。同时气相色谱检测结果显示，HOM2基因一个等位基因敲除的突变株RY1-1黄酒发酵所产生的异戊醇含量出现了明显的下降。突变株RY1-1去除KanMX抗性基因后，得到的突变株RY1-2的基本发酵性能和产高级醇含量与RY1-1相比基本保持不变。HOM2基因的敲除能够显著降低异戊醇的生成量这一实验结果与Styger[71]等人的研究结果相同。HOM2基因编码的天冬氨酸β-半醛脱氢酶是苏氨酸和蛋氨酸生物合成途径中的关键酶，但de Robichond-Szulmajster[84]等人曾于1965年指出天冬氨酸β-半醛脱氢酶在Ehrlich代谢途径最后一步反应中能够起到直接的作用，是高级醇代谢途径中的重要酶。
3.4 HOM2基因两个等位基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响 3.4.1 重组质粒pUC-HB1A1K的构建
3.4.1.1 目的片段的扩增
为了提高同源重组效率，缩进设计同源臂，以HOM2基因的一部分（分别命名为HA1片段和HB1片段）作为同源臂。以黄酒酵母RY1基因组为模板，利用一对引物
44
相关推荐：
loading