天津科技大学硕士学位论文
倍数的增加而增加，所以合理适当的加大酵母菌的接种量可以减少其增殖倍数，由此也相应的减少了高级醇的生成量[47]。 1.3.2.5 发酵温度
在黄酒发酵过程中，发酵温度是酵母菌参与生化反应的非常重要的外界因素。一般情况下，如果改变发酵温度，那么黄酒中高级醇的种类及数量也会发生改变，从而影响到各种高级醇之间的平衡[48]。若发酵温度过高，那么酵母菌对氨基酸的脱氨基作用就会加速，同时还会加速酵母菌自溶产生大量氨基酸，由于发酵温度过高造成的这两种反应都会增加高级醇的生成量。所以通过降低发酵末期的温度，抑制酵母菌的活动能力，可以降低高级醇生成量。 1.3.2.6 溶氧
酵母菌属于兼性厌氧微生物，在有氧条件和无氧条件下均可以生长。但是酵母菌在有氧条件和无氧条件下的生理代谢活动是不同的，酵母菌在高含氧量条件下比在低含氧量条件下的生长代谢旺盛。酵母菌在溶氧高的发酵条件下形成的高级醇含量明显增加，这一点在葡萄酒和啤酒的酿造工艺中都有所证实[49]。 1.3.2.7 其他等因素
周天银等[50]研究发现，糖化酶的添加量会影响高级醇的生成，并且这一点已经在生产中得到了实践。当发酵醪中糖化能力不能满足酵母所需时，为加快其糖化速度可以加入一定量的糖化酶，使发酵醪中糖化力与酵母的发酵力达到平衡，这样就加快了酵母的发酵速度。发酵过程中，在保证酵母细胞量充足的情况下，减少其增殖倍数，这样酵母细胞不但能迅速消耗糖分，而且能大大减弱对氨基酸的分解作用，这样就能大大降低高级醇的生成量。
武庆尉等[51]研究发现，酸性蛋白酶的添加量也能改变高级醇的生成量，适当地增加酸性蛋白酶的使用量时，高级醇的生成量最多可降低24.71%，但是酸性蛋白酶的添加量过多时又会使高级醇的含量增加。
在黄酒发酵过程中，发酵醪中酵母细胞的总数控制在一定范围内，使其发酵力、糖化力及蛋白分解力三者达到平衡协调时，则能够更有效的降低高级醇的含量。
除了以上因素，很多文献中也表明离子水平、pH值等因素也会对发酵醪中微生物的代谢产生一定的影响，从而进一步地影响高级醇的生成量。
1.3.3 降低黄酒中高级醇含量的主要措施
1.3.3.1 选育低产高级醇黄酒酵母菌株
即使在相同的酿造工艺条件下，不同的黄酒酵母菌株由于其生理代谢活动的不同，所以其发酵过程中生成高级醇的含量也会存在极大的差异。根据生成高级醇的两条代谢途径，选育高级醇代谢过程中某些关键性酶活性降低或失活的菌株，从而可以阻断或减弱生成高级醇的代谢途径，以达到显著降低黄酒中高级醇含量的目的[47]。
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1 前言
1.3.3.2 优化黄酒发酵工艺
选用蛋白质含量低的黄酒生产用原料，并提高原料的精白度，以去除部分原料表皮中所含有的蛋白质。以较低温度浸渍较长时间，以使原料中的部分蛋白质因分解而被除去。选择适宜的制曲工艺，经选育得到优良的曲霉菌种，以控制其产酶数量。严格控制黄酒发酵温度，使其不能超过工艺要求，并降低发酵末期的温度。适当增加酵母接种量并严格控制发酵醪中的溶氧。 1.3.3.3 黄酒后处理工艺控制高级醇含量
根据高级醇的理化性质，可以通过以下方法降低半成品黄酒中的高级醇含量。 （1）黄酒中高级醇分子的直径一般比酒中其他主要成分分子的直径大，根据这一特点，可以利用滤膜装置来截留分子直径较大的高级醇分子[52]。同时也可以利用大孔型吸附树脂达到定向吸附酒中高级醇分子的目的[53]，从而降低黄酒中的高级醇含量。
（2）通过通风处理、热处理等一些理化手段[54]，能够加速酒体中高级醇成酯成酸的生化反应，从而不但降低了酒体中高级醇的含量，而且形成了能够提高黄酒品质的风味物质。
1.4 低产高级醇酵母菌株的研究进展
在酵母发酵过程中，可以通过优化酿酒工艺来控制高级醇的生成，而基于代谢控制理论，通过影响或者改变酵母菌株的代谢途径，从根本上降低高级醇的生成，不但可以降低生产成本，还能提高黄酒的品质。根据酵母菌生成高级醇的两条代谢途径，人们对高级醇的形成及其代谢调控做了更进一步的研究，并且由此产生了一些能够降低发酵过程中高级醇生成量的思路和方法。
1.4.1 诱变育种
诱变育种是一种有效而且容易操作的育种方法，常用于选育低产高级醇酵母菌株。有多种方法可以对酿酒酵母进行诱变处理，其中普遍采用的物理诱变方法为紫外线诱变，化学诱变方法有亚硝酸诱变、亚硝基胍诱变等。
在Ehrlich代谢途径中，氨基酸分解生成相应的高级醇的反应过程，是由酵母细胞中的氨基酸转氨酶、酮酸脱羧酶、脱氢酶等酶的催化活性决定的。因此，根据代谢控制原理，选育分支链氨基酸营养缺陷型菌株，由于其不能合成相应的氨基酸合成途径中的某些酶尤其是和高级醇的生成有关的酶，因而减少了α-酮酸的积累，由于α-酮酸是合成高级醇的前体物，所以达到了降低高级醇生成量的目的。Rous[55]等人通过紫外诱变的方法选育出一株异亮氨酸营养缺陷型突变菌株，用该突变株进行葡萄酒发酵时生成的异戊醇的含量比出发菌株降低了50%，同时总高级醇的生成量降低了20%。王鹏银[56]等人利用N+离子注入技术诱变并筛选到了一株亮氨酸营养缺陷型酿酒酵母菌株A713，该突变株发酵产异戊醇含量降低了39.85%，且总高级醇含量降低了33.62%。赵树欣[57]等人利用离子注入与紫外诱变经二重诱变筛选得到的突变株，其生成的总高
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级醇含量降低了34.5%。Ingraham[34]等人选育出了亮氨酸营养缺陷型突变株，该突变株发酵产异戊醇的含量降低了95%，但由于该突变株需要在富含亮氨酸的培养基中生长，而且其发酵性能也明显降低，所以限制了该菌在工业上的应用。
诱变育种的方法虽然简单易操作，但其缺点也是显而易见的。首先，诱变育种得到的菌株大多数都是营养缺陷型菌株，在其发酵过程中要向发酵液中补加维生素、氨基酸等营养物质，所以不利于工业化生产。其次，进行诱变后需要大量处理供试菌株，而且诱变育种的方式由于诱发突变的盲目性大、难以掌握方向，所以筛选到的目的菌株很少，同时也很难将不同目的性状集中到同一株菌，另外，筛选得到的目的菌株也容易发生回复突变。
1.4.2 细胞融合育种
细胞融合又称为原生质体融合，该技术也常用于选育酵母菌种。
Nobuhiko[58]等人将赖氨酸营养缺陷型菌株K-14和呼吸缺陷型菌株NCYC1333进行细胞融合，从而得到了耐酒精力高、絮凝性较低、高级醇生成量适中的优良菌株F-32。王芬[59]等将发酵度高、产乙醛量低，但产高级醇含量高的菌株NW7-45与发酵度不高但产高级醇量少的菌株JW1-1进行融合反应，选育出了发酵度高且产高级醇量低的优良菌株DR9-2。
细胞融合育种存在过程比较繁琐且得到的目的菌株后代会出现性状分离等缺点，因而限制了该技术在工业育种方面的应用。
1.4.3 基因工程育种
基因工程育种指的是利用分子生物学手段在分子水平上按照人们的意愿对菌株进行有目的的改造，从而提高有利发酵产物的生成量或者降低不利发酵产物的生成量。与传统育种方法相比，基因工程育种具有针对性强、遗传性能稳定、周期性短等优点，并克服了远源杂交不亲和性，所以说基因工程育种是一种非常优越的育种方法。结合酵母中高级醇生成的两条代谢途径，许多科学家对降低酿酒酵母生成高级醇的含量，尤其是降低其生成异丁醇和异戊醇的含量进行了大量且深入的研究。 1.4.3.1 支链氨基酸转氨酶对高级醇生成量的影响
Colón[60]，Kispal[61]和Eden[21]等人对酵母中支链氨基酸分解生成高级醇的代谢途径进行了大量深入的研究，他们的研究成果表明，该途径的第一步反应为支链氨基酸的转氨作用，该反应是由支链氨基酸转氨酶控制的，支链氨基酸转氨酶分为线粒体支链氨基酸转移酶和细胞质支链氨基酸转移酶两种，且分别由BAT1基因和BAT2基因编码，酿酒酵母中，BAT1基因编码的线粒体支链氨基酸转氨酶在其对数生长期活性很高，但是在稳定期活性较低；而BAT2基因编码的细胞质氨基酸转氨酶在其稳定期活性很高，但在对数期活性较低[61-62]。在支链氨基酸分解生成高级醇的代谢途径中，支链氨基酸转氨酶的缺失可阻断或者减弱支链氨基酸转变成α-酮酸的生成量，进而减少亮氨酸生成异戊醇及缬氨酸生成异丁醇的产量。Eden[21]等人的研究结果表明，敲除
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1 前言
BAT1基因或者敲除BAT2基因时，都基本没有影响正丙醇的生成量，但敲除BAT2基因对异丁醇和异戊醇的生成量有较大的影响。Yoshimoto[63]等人的研究结果表明，BAT2基因缺失突变株发酵生成异丁醇和异戊醇的产量分别降低了72%和40%。Lilly[64]等人的研究结果表明，BAT2基因缺失突变菌株发酵生成异丁醇的含量显著下降。Nissim[65]等人构建的BAT1和BAT2基因敲除的突变株，其异丁醇的生成量显著降低，但是没有报导该突变株异戊醇的生成量及其发酵性能的变化情况。 1.4.3.2丙酮酸脱羧酶对高级醇生成量的影响
丙酮酸脱羧酶是氨基酸分解代谢途径中催化α-酮酸脱羧成醛的关键酶，Yoshimoto[66]等人构建了编码丙酮酸脱羧酶的PDC1基因缺失的突变株，其异戊醇的生成量下降了31%。Dickenson[67-69]等人研究发现，由YDL080C基因编码的类丙酮酸脱羧酶是α-酮基异己酸分解形成异戊醇的关键酶，构建YDL080C基因缺失的突变株，能够阻断或者减弱α-酮基异己酸转化形成异戊醇的途径，从而降低异戊醇的生成量。 1.4.3.3醇脱氢酶对高级醇生成量的影响
醇脱氢酶是高级醇形成途径中催化醛类还原形成高级醇的重要酶，Atsumi[70]等人指出ADH2基因编码的醇脱氢酶是催化异丁醛和异戊醛形成异丁醇和异戊醇的关键性酶，通过过量表达ADH2基因，显著提高了异丁醇和异戊醇的生成量。 1.4.3.4 天冬氨酸β-半醛脱氢酶对高级醇生成量的影响
Styger[71]等人研究指出，HOM2基因编码的天冬氨酸β-半醛脱氢酶对高级醇的生成有重要影响，构建的HOM2基因缺失菌株生成异丁醇和异戊醇的含量有显著性降低。
1.4.3.5 醇乙酰基转移酶对高级醇生成量的影响
Yoshimoto[63]等人构建的过表达ATF1的菌株，其发酵生成异戊醇和异丁醇的含量分别降低了74%和52%；Fukuda[72]等人构建的同时过表达ATF1和ATF2的菌株，不但提高了菌株乙酸酯合成酶的活力，而且还显著降低了异戊醇的生成量；本实验室张建炜[73]等人构建的过量表达ATF1的菌株，其生成异戊醇的含量下降了50%。
1.5 本课题的立题依据及研究内容 1.5.1本课题的立体依据
黄酒是我国的民族特产，深受广大人民群众的喜爱。人们的生活水平和物质文化日益提高，同时消费者对黄酒这种消费品的品质要求也在不断提高和变化，包括黄酒的风味口感和营养价值等，特别是消费者随着对黄酒的认识越来越高，对形成其风味的微量成分也越来越重视。
高级醇是黄酒的重要风味物质之一，适宜的高级醇含量及各种高级醇含量之间比例的协调可以使酒体丰满圆润，口感柔和协调；如果高级醇含量过高，不但会给酒体带来不愉快的异杂味，影响黄酒的品质，而且有较强的致醉性，危害人的身体健康。
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