天津科技大学硕士学位论文
目前的检测数据显示，在所有酿造酒中，黄酒中高级醇的含量是最高的。因此降低黄酒中高级醇含量适应健康、安全、卫生的消费趋势。
利用现代生物工程技术降低黄酒中高级醇含量是我国黄酒酿造行业重要的研究课题。许多厂家和科研机构对降低黄酒中高级醇含量进行了大量研究和探讨，主要集中在原辅料的选择和发酵工艺两个方面，但是要想从根本上提高黄酒的品质，降低生产成本，最为关键的是选育低产高级醇的优良酿酒酵母菌株。酿酒酵母生成高级醇的两条代谢途径是在众多酶的催化作用下完成的，这些酶分别是由一个或一系列相关基因编码的，为确定影响高级醇代谢途径的关键基因，本实验拟采用基因工程育种手段，敲除某些直接或间接参与高级醇代谢途径的酶的编码基因，研究基因敲除对高级醇生成量的影响。
本实验室前期实验过程中，郝欣等人构建了BAT2基因敲除突变株，该突变株进行酒精浓醪发酵实验的结果表明，突变株的基本发酵性能与出发菌株基本相同，产异丁醇和异戊醇的含量分别降低了55%和34%；戴龙海等人构建了BAT2基因敲除单倍体菌株，该突变株进行黄酒发酵实验的结果表明，突变株产异丁醇和异戊醇的含量分别降低了37%和12%左右，同时，敲除BAT2基因对黄酒酵母菌株的基本发酵性能无明显影响。以上结果显示，BAT2基因敲除对异丁醇的生成量有显著影响，对黄酒中含量最高的异戊醇的生成量影响不太显著，而对正丙醇则没有影响，本课题将继续研究高级醇代谢途径中的相关基因对高级醇生成量的影响。
本课题的目的是在探讨酿酒酵母高级醇代谢机理的基础上，研究BAT1、HOM2基因敲除以及BAT1和BAT2基因双敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响，为理论研究提供指导。
1.5.2 本课题的主要研究内容
本课题拟从以下几个方面展开研究：
（1）BAT1基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响。构建重组质粒pUC-BABK，通过醋酸锂转化法将重组片段BA-KanMX-BB导入黄酒酵母单倍体出发菌株中，筛选得到BAT1基因敲除突变株，并将BAT1基因敲除突变株与出发菌株进行黄酒发酵实验，研究BAT1基因敲除对黄酒酵母单倍体菌株高级醇生成量及基本发酵性能的影响。
（2）BAT1、BAT2基因双敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响。通过醋酸锂转化法将重组片段BA-KanMX-BB导入本实验室已构建好的BAT2基因敲除黄酒酵母单倍体菌株中，筛选得到BAT1、BAT2基因双敲除突变株，并将BAT1、BAT2基因双敲除突变株及其单敲除突变株与出发菌株进行黄酒发酵实验，研究BAT1、BAT2基因双敲除对黄酒酵母单倍体菌株的高级醇生成量及基本发酵性能的影响。
（3）HOM2基因一个等位基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响。构建重组质粒pUC-HABK，通过醋酸锂转化法将重组片段HA-KanMX-HB导入黄酒酵母二倍体出发菌株中，筛选得到HOM2基因一个等位基因敲除的突变株，并将HOM2基因一个等
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1 前言
位基因敲除的突变株与二倍体出发菌株进行黄酒发酵实验，研究HOM2基因一个等位基因的敲除对黄酒酵母二倍体菌株高级醇生成量及基本发酵性能的影响。然后，利用Cre/LoxP系统去除HOM2基因一个等位基因敲除的突变株中引入的KanMX标记基因。
（4）HOM2基因两个等位基因敲除对黄酒酵母高级醇生成量的影响。构建重组质粒pUC-HB1A1K，通过醋酸锂转化法将重组片段HA1-KanMX-HB1导入HOM2基因一个等位基因敲除的突变株中，筛选得到HOM2基因两个等位基因敲除的突变株，并将HOM2基因两个等位基因敲除的突变株与HOM2基因一个等位基因敲除的突变株及二倍体出发菌株进行黄酒发酵实验，研究HOM2基因两个等位基因的敲除对黄酒酵母二倍体菌株高级醇生成量及基本发酵性能的影响。
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2 材料与方法
2.1 材料与仪器 2.1.1 主要试剂
本论文所用实验试剂如表2-1所示。
表2-1 实验试剂
Table 2-1 Reagents used in this work
试剂 葡萄糖 蛋白胨 酵母浸粉 胰蛋白胨 氯化钠 无水乙醇 G418 氨苄霉素 氢氧化钠 浓盐酸 浓硫酸 PEG3350 鲑鱼精DNA 醋酸锂 Tris平衡酚 氯仿 异戊醇 硫酸铜 次甲基蓝 酒石酸钾钠 亚铁氰化钾 丙三醇 SDS 酵母破壁酶 RNaseA 蛋白酶K
生产厂家 天津市化学试剂一厂 北京奥博星生物技术公司 北京奥博星生物技术公司 天津市化学试剂一厂 天津市北方天医化学试剂厂 天津市江天化工技术有限公司 北京索莱宝科技有限公司 上海生工生物有限公司 天津市北方天医化学试剂厂 天津市北方天医化学试剂厂 天津市北方天医化学试剂厂 北京索莱宝科技有限公司 北京索莱宝科技有限公司 天津市北方天医化学试剂厂 北京索莱宝科技有限公司 天津化学试剂有限公司 天津化学试剂有限公司 天津化学试剂有限公司 天津化学试剂有限公司 天津化学试剂有限公司 天津化学试剂有限公司 天津市北方天医化学试剂厂 天津市北方天医化学试剂厂 北京索莱宝科技有限公司 北京索莱宝科技有限公司 北京索莱宝科技有限公司
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2 材料与方法
LATaq Solution I DL5000 Marker 乙酸正戊酯 正丙醇 异丁醇 异戊醇
TaKaRa中国大连公司 TaKaRa中国大连公司 TaKaRa中国大连公司 天津光复精细化工研究所 天津光复精细化工研究所 天津光复精细化工研究所 天津光复精细化工研究所
2.1.2 主要实验仪器
本论文所用实验仪器如表2-2所示。
表2-2 实验仪器
Table 2-2 Instruments and apparatuses used in this work 仪器 电热恒温水浴锅 恒温摇床 生化培养箱 电子天平 高压蒸汽灭菌锅
电热鼓风干燥箱DL102型
HS-1300-V型超净台 台式高速离心机 GL20A型高速冷冻离心机 722型光度分光光度计 pHSJ-4A型实验pH计
P型移液器
PCT-200型PCR基因扩增仪
DYY-4c型电泳仪 全自动凝胶成像仪 7890A 气象色谱仪
公司
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