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（2）用全自动生长曲线分析仪测定菌株的生长曲线：接种量为2%～5%梯度接种，培养温度为30℃，600 nm紫外光下测定吸光值，每隔1 h测定一次菌液的OD值。
（3）以培养时间为横坐标，OD600为纵坐标，绘制菌株的生长曲线。
2.3 实验方法 2.3.1 引物设计
本实验中所用全部引物序列见表2-4。
（1）BAT1基因单敲除突变株及BAT1、BAT2基因双敲除突变株的构建及验证所需引物
根据GenBank报道的BAT1基因序列设计一对引物BAT1-U和BAT1-D，用于验证黄酒酵母基因组中BAT1基因的存在。在BAT1基因外部的上下游分别设计一对引物BA-U和BA-D及BB-U和BB-D，分别扩增BAT1基因两侧非编码区的片段BA和BB，用于同源重组敲除BAT1基因。根据质粒pUG6序列设计一对引物K-U和K-D扩增KanMX基因，作为抗性筛选标记。在BA片段的上游设计引物B-S和在KanMX序列内部设计引物K-S-BAT1用于BAT1基因单敲除突变株的上游验证，在KanMX基因内部设计引物K-X-BAT1和在BB片段的下游设计引物B-X用于BAT1基因单敲除突变株的下游验证。BAT1、BAT2基因双敲除突变株的验证和BAT1基因单敲除突变株的验证相同。
（2）HOM2基因一个等位基因敲除的突变株RY1-1的构建及验证所需引物 根据GenBank报道的HOM2基因序列设计一对引物HOM2-U和HOM2-D，用于验证黄酒酵母基因组中HOM2基因的存在。在HOM2基因外部的上下游分别设计一对引物HA-U和HA-D及HB-U和HB-D，分别扩增HOM2基因两侧非编码区的片段HA和HB，用于同源重组敲除HOM2基因。在HA片段的上游设计引物H-S和在KanMX序列内部设计引物K-S-1用于HOM2基因一个等位基因敲除的突变株的上游验证，在KanMX基因内部设计引物K-X-1和在HB片段的下游设计引物H-X用于HOM2基因一个等位基因敲除的突变株的下游验证。
（3）HOM2基因两个等位基因敲除的突变株RY1-3的构建及验证所需引物 在HOM2基因保守区的两端分别设计一对引物HA1-U和HA1-D及HB1-U和HB1-D，分别扩增HOM2基因的部分片段（分别命名为HA1片段和HB1片段），用于同源重组中断HOM2基因。在HA1片段的上游设计引物H-S和在KanMX序列内部设计引物K-S-2用于HOM2基因两个等位基因敲除的突变株的上游验证，在KanMX基因内部设计引物K-X-2和在HB1片段的下游设计引物H-X用于HOM2基因两个等位基因敲除的突变株的下游验证。
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2 材料与方法
表2-4 PCR反应引物
Table 2-4 PCR primers used in this study
Primer name BAT1-U BAT1-D BA-U BA-D BB-U BB-D B-S K-S-BAT1 K-X-BAT1 B-X HOM2-U HOM2-D HA-U HA-D HB-U HB-D H-S K-S-1 K-X-1 H-X HA1-U HA1-D HB1-U HB1-D K-S-2 K-X-2 Kan-U Kan-D Zeocin-U Zeocin-D
Sequence (5′→3′)
5′- CATGTTGCAGAGACATTCCTTG-3′ 5′- CATTAGTTCAAGTCGGCAACAG-3′
5′-CCGGAATTCATACCGGCTGTCGCTATTATTACTG-3′ 5′-CGCGGATCCCAACTTCAAGGAATGTCTCTGCAAC -3′ 5′-CGCGGATCCGTAACTGGTCAAAAACTGTTGCCGA-3′ 5′-TGCACTGCAGCAGCGAGATACCTTGGCAACTAAAT-3′ 5′-GCATATCTGCTCAAGTAGACAAGG-3′ 5′-GGGCAATCAGGTGCGACAATCTA-3′ 5′-CAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTC-3′ 5′-CTGTATGCCACGATGATGGAAGG-3′ 5′- TGGGTGCTACTGGTTCCGTTGGT-3′ 5′- GGCAATCAAGACACCAGAACCAGC-3′
5′-CCCAAGCTTGCAGCAGCCTTGCCCTTTTACAC-3′ 5′-CGCGGATCC ACCAACGGAACCAGTAGCACCCA -3′ 5′-CGCGGATCC GGTTCTGGTGTCTTGATTGCCGAAATC-3′ 5′-CGGGGTACCACAGTGCTATTGTGAGTGTATCCCAGC-3′ 5′-GCTAAACACGCCTGTGGTCATTC-3′ 5′-CGGATAAAATGCTTGATGGTCGGA-3′ 5′-CGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGT-3′ 5′-GGAAGGCACTACTGAGCCAAATG-3′
5′-CCCAAGCTTGCTGGTGTTTTGGGTGCTACTG-3′ 5′-CGCGGATCCCGATAGCGCCAGCATAGTCAGC -3′ 5′-CGCGGATCCCAAGAACAGACCTGCTCCATCC -3′ 5′-CCGGAATTCATCAAGACACCAGAACCAGCGG-3′ 5′-GGGCAATCAGGTGCGACAATCTA-3′ 5′-CAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTC-3′ 5′-CGCGGATCCCAGCTGAAGC TTCGTACGC-3′ 5′-CGCGGATCCGCATAGGCCACTAGTGGATCTG-3′ 5′-ATCGTCGACCCCACACACCATAGCTTCA-3′ 5′-GCGGTCGACAGCTTGCAAATTAAAGCCTT-3′
Restriction
site None None EcoRI BamHI BamHI PstI None None None None None None Hind III BamHI BamHI KpnI None None None None Hind III BamHI BamHI EcoRI None None BamHI BamHI None None
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2.3.2 各目的基因片段的获得
2.3.2.1 酵母基因组DNA的提取
采用solarbio酵母基因组DNA提取试剂盒提取。其操作步骤如下:
（1）取斜面酵母菌种一环于装有5 mL YEPD液体培养基的试管中，30℃静置培养过夜。
（2）取适量酵母菌液（不超过5×107 cells）于1.5 mL EP管中，12000 rpm离心1 min，尽量去除上清；向菌体中加入470 μL山梨醇Buffer，充分悬浮酵母菌体，再加入25 μL酵母破壁酶及5 μL β-巯基乙醇，上下颠倒充分混匀，30℃温度下放置1~2 h。
（3）12000 rpm离心1 min，弃除上清，并收集沉淀。
（4）向上述沉淀中加入200 μL溶液A，并用枪头吹吸以充分悬浮沉淀，然后向悬浮液中加入20 μL（10 mg/mL）的RNaseA，并充分颠倒混匀，于室温放置10 min。
（5）然后加入20 μL（10 mg/mL）的蛋白酶K，并充分颠倒混匀，在65℃水浴中消化15~30min，消化期间可以颠倒混匀数次，直到样品完全消化为止。
（6）消化完全后加入200 μL溶液B，200 μL无水乙醇，并充分地颠倒混匀，这时可能有絮状沉淀产生，并不影响DNA的提取（可以将溶液与絮状沉淀都加入到吸附柱中，然后室温放置2 min，最好能充分混匀以减少沉淀）。
（7）12000 rpm离心2 min，弃掉废液，然后将吸附柱重新放入收集管中。 （8）向吸附柱中加入700 μL的漂洗液（在使用之前应先检查是否已经加入无水乙醇），12000 rpm离心1 min，弃掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。
（9）向吸附柱中加入500 μL漂洗液，12000 rpm离心1 min，弃掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。
（10）12000 rpm离心2 min，将吸附柱敞口放置于室温或50℃温箱数分钟，其目的是将吸附柱中残留的漂洗液除去，否则残留漂洗液中的乙醇会影响到后续的实验，如酶切、PCR等。
（11）将吸附柱放于干净的1.5 mL EP管中，然后向吸附膜中央悬空滴加50~200 μL预先经过65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5 min，12000 rpm离心2 min。
（12）将上述离心所得洗脱液再重新加入到吸附柱中，室温静置5 min，12000 rpm离心2 min，即得到高质量的基因组DNA。 2.3.2.2 各基因片段的PCR扩增
（1）PCR反应体系加样量如表2-5。
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2 材料与方法
表2-5 PCR反应体系 Table 2-5 PCR reaction system
成分
10×LA Taq Buffer dNTPs (2.5 mmol/L)
加样量 2 μL 1.5 μL
上游引物(10 μmol/L) 1 μL 下游引物(10 μmol/L) 1 μL 模板 LATaq酶 ddH2O
质粒0.5 μL/基因组1 μL 0.5 μL Add to 20 μL
（2）PCR反应条件见表2-6。
表2-6 PCR反应条件
Table 2-6 Reaction conditions of PCR
步骤 预变性 变性 退火 延伸 终延伸
温度 95℃ 94℃ X℃ 72℃ 72℃
时间 5 min 40 s 1 min 1-3 min 10 min
注：X与引物有关，一般比其Tm值小5 ℃~10 ℃
变性至延伸部分共循环30次，退火温度X由各目的基因片段的引物情况决定。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。 2.3.2.3 琼脂糖凝胶电泳
（1）根据所需要的浓度（0.8%~1.5%）称取一定量的琼脂糖，然后加入一定量的1×TAE电泳缓冲液，放入微波炉中加热使琼脂糖完全溶解。
（2）将完全溶解的琼脂糖倒入制胶模具，一般使凝胶厚度在0.3~0.5 cm，然后迅速地在模具一端插上梳子，并检查有无气泡。
（3）室温条件下放置30~45 min，直到琼脂糖溶液完全凝固，小心地拔出梳子后，将凝胶放置于电泳槽中。
（4）向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液并使其液面高出胶面1 mm左右。 （5）取一定量的DNA样品与适量的6×上样缓冲液混合均匀，然后用移液枪加入到样品孔中。
（6）接通电泳槽与电泳仪的电源，然后将电压降选择1~5 V/cm。
（7）根据上样缓冲液迁移的位置判断是否终止电泳，切断电源，取出凝胶后放
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