生 化 制 药 技 术
威海职业学院
生物与化学工程系
二0一一年二月
目 录
前言……………………………………………………………………………………………1 项目一 L-胱氨酸的制备与鉴定……………………………………………………………2 项目二 溶菌酶的制备………………………………………………………………………4 项目三 卵磷脂的制备及鉴定………………………………………………………………6 项目四 甘露醇的制备及鉴定………………………………………………………………7 项目五 芦丁的提取与鉴定…………………………………………………………………9 参考文献 ……………………………………………………………………………………11
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前 言
《生化制药技术》是生化制药技术专业的专业核心课程之一，生化制药技术实验实训指导书是本课程的重要组成部分。根据该课程教学大纲的规定，学生在掌握一定生化药品制备技术理论知识的基础上，必须通过实验实训学习，掌握生化药品制备常用的提取、分离、精制、干燥等方法和实验操作技术，培养学生科学认真的工作态度和熟练的基本操作技能。
本实验实训指导书的编写，主要参照《生化制药技术》、《现代生物制药工艺学》、《天然植物化学》等参考资料所收载的部分内容，结合本专业实训基地现有的实验实训条件，从中选出较为典型的生化药品实例的制备方法，供学生实验学习使用。
实验设计包括氨基酸、蛋白质、酶、脂及多糖类等，生化药品制备与鉴定基本操作技术，以培养学生进行生化药品的生产制造与鉴别的能力。
为了完成本课程实验实训教学大纲的学习内容，要求学生实验实训课前，必须认真预习，明确实验目的，熟悉实验内容和方法，并结合课堂教学，理解实验的基本原理；实验中必须有严谨的科学态度和实事求是的工作作风；严格操作，正确使用仪器，认真观察实验现象，详细、真实地做好实验原始记录；实验报告要求书写正确规范；严格遵守实验室规章制度，注意安全，保持室内卫生。
本实验实训指导书由李顺康、高英霞、殷永新、肖凤华、元超老师编写完成，主要供生化制药技术实验实训的学生参考。
由于编者按水平有限，加之时间仓促，如有不当之处，恳请读者批评指正。
——编者
项目一 L-胱氨酸的制备及鉴定
一、实验目的要求
1、熟悉用人发制备氨基酸类药物的原理。 2、掌握水解法制备氨基酸的方法。 二、实验重点和难点 L-胱氨酸的制备与精制方法。 三、实验原理
蛋白质由一定数量的氨基酸经过特定的排列方式组合而成的。因此，在一定条件下将蛋白质水解可得到各种氨基酸的混合液，再经过进一步的提取、精制，即可得到所需
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的氨基酸。
本实验是用已洗净并干燥的人发，先用酸水解，然后调节pH至胱氨酸等当点（5.05左右）时，胱氨酸从水解液中沉淀出来，经精制得到其结晶。
四、实验仪器、试剂与材料
1、仪器：500ml短颈圆底烧瓶、冷凝管、电热套、玻璃漏斗、玻璃棒、抽滤瓶、布氏漏斗、恒温水浴锅、真空泵、表面皿、烧杯、滤纸。
2、试液：（1）10mol/L盐酸溶液：取盐酸90ml加水稀释至100ml，摇匀，即得。 （2）6%盐酸溶液：取盐酸6ml加水稀释至100ml，摇匀，即得。
（3）10%氢氧化钠溶液：取氢氧化钠10g，加水溶解，放冷，加稀释至100ml，摇匀，即得。
（4）25%氢氧化钠溶液：取氢氧化钠25g，加水溶解，放冷，加稀释至100ml，摇匀，即得。
（5）10%氨水溶液：取氨10ml加水稀释至100ml，摇匀，即得。
（6）2%硫酸铜溶液：取硫酸铜2g，加水溶解并稀释至100ml，摇匀，即得。 （7）0.1íTA溶液：取乙二胺四乙酸二钠0.1g，加水溶解并稀释至100ml，摇匀，即得。
（8）75%乙醇溶液：取无水乙醇75ml加水稀释至100ml，摇匀，即得。
（9）0.5%茚三酮-丙酮溶液：取茚三酮0.5g，加丙酮溶解并稀释至100ml，摇匀，即得。
3、试剂与材料：胱氨酸对照品、粉末活性炭、苯酚、盐酸、氢氧化钠、氨、硫酸铜、乙二胺四乙酸二钠、无水乙醇、95%乙醇、茚三酮、丙酮、人发。
五、实验操作
1、人发的处理：取无染色的人发，用碱性或中性洗涤剂洗净，用清水洗至水呈中性，晾干并剪短备用。
2、回流装置安装：在回流冷凝管上端接一弯玻璃管，下连一小漏斗用水封住，漏斗刚好接触水面，但不能伸到水中以免倒吸，避免氯化氢气体自仪器中逸出到空气中。
3、水解：称取人发50g，置圆底烧瓶中，加10mol/L盐酸溶液100ml，加沸石或玻璃珠3粒，加热回流6～7小时，回流过程保持缓缓沸腾。
水解完全后应不呈双缩脲反应，可停止反应，否则应继续水解至反应完全。 4、双缩脲检查：取水解液3ml，加入少量粉末活性炭，在80℃水浴中脱色数分钟，过滤；向滤液中加10%氢氧化钠溶液3ml使呈碱性，然后沿管壁加2%硫酸铜溶液4～5滴，观察有无紫红色出现，若出现，水解未完全需继续水解。
5、胱氨酸粗品制备：将水解液趁热过滤除去残渣，滤液呈深棕色。当滤液温度降至60℃左右时在不断搅拌下，逐滴加入25%氢氧化钠溶液调pH至4.8～5.0，即产生胱氨酸沉淀。然后，置冷处过夜使沉淀完全，次日将沉淀置布氏漏斗中抽滤，并于50～
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60℃干燥，得到胱氨酸粗品Ⅰ。
6、结晶：称取胱氨酸粗品Ⅰ放入100ml烧杯中，加粗品4倍量4%盐酸溶液，加热至80℃左右，在不断搅拌下加约相当于胱氨酸粗品量15%的粉末活性炭，搅拌50分钟趁热抽滤。将滤液置于恒温水浴中加热至60℃不断搅拌下慢慢加25%氢氧化钠溶液，调pH至4.8～5.0，即有白色结晶迅速析出，放置5～6h后（在更长时间酪氨酸也可能与胱氨酸一同结晶出来）抽滤，得胱氨酸粗品Ⅱ。
7、再次脱色并脱铁：取胱氨酸粗品Ⅱ放入100ml烧杯中，加8倍粗品Ⅱ量6%盐酸溶液、5%粗品Ⅱ量粉末活性炭与0.1íTA溶液2ml，在80℃恒温水浴中搅拌30分钟，趁热减压抽滤。
8、重结晶精制：将滤液置于60℃恒温水浴中，逐滴加10%氨溶液，调pH值至4.0（必须一滴一滴加，并不停的搅拌）左右，白色的胱氨酸结晶逐渐析出，放置过夜，抽滤，用少量纯化水洗涤结晶，再用75%乙醇洗涤，抽干。将胱氨酸纯品置表面皿上，于50～60℃干燥，称重，计算产率。
9、纯度鉴定：称取胱氨酸样品与对照品适量，配成相同浓度的溶液，用纸色谱法检查，以苯酚：水（7：3）为展开剂，以0.5%茚三酮-丙酮溶液为显色剂。在色谱图上应为单一斑点，Rf值应符合规定。
六、结果与讨论
1、计算胱氨酸收率，讨论影响收率的因素。 2、根据纸色谱结果分析所制备的胱氨酸纯度。
项目二 溶菌酶的制备
一、实验目的要求
1、熟悉鸡蛋清制备溶菌酶的原理。
2、掌握树脂吸附法、透析法及盐析法用于制备酶类药物的基本操作方法。 二、实验重点和难点
从蛋清中制备溶菌酶的工艺和操作方法。 三、实验原理
溶菌酶（EC3.2.1.17），又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基及芳香族氨基酸（如色氨酸）的比例很高。pH在l.2～11.3范围内剧烈变化时，其结构几乎不变，遇热也很稳定。在pH4～7，10O℃处理lmin仍保持原酶活性；pH5.5，5O℃加热4h后，酶变得更活泼；热变性是可逆的，变性的临界点是77℃。随溶剂的变化变性临界点也有变化，当变性剂在pH1以下时，变性临界点降低到43℃。变性剂能促进酶的热变性，但变性剂过量时则酶的热变性变为不可逆。在碱性环境中用高温处理时，酶活性降低。
十二烷基磺酸钠等对酶有抑制作用；滤纸也能抑制酶活性；氧化剂能使酶纯化；
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在6mol/L的盐酸胍溶液中酶完全变性；而在lOmol/L尿素中酶则不变性；用乙二醇、丙烯乙二醇、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、二氧杂环乙烷等有机溶剂进行变性实验，在5O℃以下时除乙醇、二氧杂环乙烷外，其他变性剂的浓度要在50%以上时才能使溶菌酶变性；氢氰酸能部分恢复酶活力。
四、实验仪器、试剂与材料
1、仪器：磁力搅拌器、电热套、电炉、蒸馏装置、压片机、真空抽滤装置、透析袋、电动搅拌器、真空干燥箱。
2、试液：
（1）0.15mol/L磷酸缓冲液（pH6.5）：取磷酸二氢钾0.68g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液15.2ml，用水稀释至100ml，即得。
（2）10%硫酸铵溶液：取硫酸铵10g，加水溶解并稀释至100ml，摇匀，即得。 （3）lmol/L氢氧化钠溶液：取氢氧化钠4g，加水溶解，放冷，加稀释至100ml，摇匀，即得。
（4）3mol/L盐酸溶液：取盐酸27ml加水稀释至100ml，摇匀，即得。
3、试剂与材料：乙醇、乙醚、无水硫酸钠、丙酮、磷酸、硫酸铵、氢氧化钠、氯化钠、淀粉、砂糖、滑石粉、鸡蛋、724树脂、漏斗、滤纸、60～80目筛子。
五、操作步骤
1、原料处理：新鲜蛋清250g，测pH为8左右，除去蛋清中的脐带、蛋壳碎片及其他杂质。
2、吸附：温度降到5℃左右，在搅拌中加入处理好的724树脂50g（湿重）使树脂全部悬浮在蛋清中，在0～5℃搅拌吸附5h，再将蛋清在0～5℃静置过夜。
3、去杂蛋白、洗脱、沉淀：渐渐倾出上清液，树脂用清水洗去吸附的蛋白质，反复洗4次，注意防止树脂流失，最后将树脂抽滤去水分。另取0.15mol/L磷酸缓冲液（pH6.5）15Oml分3次加入树脂中搅拌l5min，每次搅拌后减压抽滤去水分，再取10%硫酸铵溶液200m1，分4次洗脱溶菌酶，每次搅拌半小时，过滤抽干，合并洗脱液，按总体积加入32%固体硫酸铵（质量体积比）使含量达到40%，有白色沉淀析出。冷处放置过夜虹吸上清液，沉淀离心分离或抽滤，得粗制品。
4、透析：将粗制品加纯化水50ml使溶解，装入透析袋中在0～5℃透析24～36h，除去大部分硫酸铵，得透析液。
5、盐析：向澄清透析液中慢慢滴加lmol/L氢氧化钠溶液，随加随搅拌至pH值为8.5～9，如有白色沉淀应立即离心除去。然后在搅拌下加入3mol/L盐酸溶液使pH为3.5，按体积比缓缓加入5%固体氯化钠，即有白色沉淀析出。在0.5℃放置48h离心或过滤溶菌酶沉淀。
6、干燥：沉淀加入10倍量冷至O℃的无水丙酮，不断搅拌使颗粒松散。冷处静置数小时，用漏斗滤去丙酮，沉淀用真空干燥直至无水丙酮脱水，即得溶菌酶。
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