HPLC测定黄芪甲苷概况

HPLC测定黄芪甲苷概况

黄芪甲苷(AstragalosideⅣ)是中药黄芪中的特征性成分,目前黄芪药材以及含黄芪的单方及复方中药制剂大多以黄芪甲苷为质量评价指标,由于黄芪甲苷只在紫外末端有吸收,以往文献报道以薄层扫描方法居多,近年来,通过HPLC方法测定黄芪甲苷以其在准确性、重现性、灵敏度等方面的优势而逐渐为人们广泛使用,本文对近五年来HPLC法测定黄芪药材及制剂中黄芪甲苷的前处理方法及色谱条件两方面综述如下。 1 前处理

1.1 提取纯化 黄芪本身含有多种成分,复方中药成分更加复杂,而黄芪甲苷的含量相对较低,在药材中最高含量不到0.2%[1],因此在HPLC测定前进行适当有效的前处理对于保护色谱柱和提高供试液中黄芪甲苷含量都非常必要。

1.1.1 样品[2](合剂) 置分液漏斗中,乙醚提取,弃去乙醚液(乙醚脱脂),水层用水饱和正丁醇提取,合并正丁醇提取液(正丁醇提取),1%氢氧化钠溶液洗涤正丁醇液,再用正丁醇饱和的水洗至中性(1%氢氧化钠处理),蒸干,残渣用甲醇溶解定容。

1.1.2 样品[3](黄芪口服液) 正丁醇提取,1%氢氧化钠处理,蒸干,残渣加水溶解后上D101大孔吸附树脂柱,先后用水和30%乙醇洗脱,弃去洗脱液,用70%乙醇洗脱,收集洗脱液,蒸干,甲醇定容。

1.1.3 样品[4](黄芪注射液) 加氢氧化钾,振摇使溶解,正丁醇提取,1%磷酸二氢钠水溶液洗涤,蒸干,甲醇定容。

1.1.4 样品[5](复方口服液) 正丁醇提取,1%氢氧化钠处理,蒸干,残渣用水溶解,上大孔树脂柱,先用水洗,再以75%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,蒸干,甲醇定容。

1.1.5 样品[6](黄芪药材) 粉碎,乙醚脱脂。将药材置索氏提取器中,加甲醇提取,回收甲醇,提取液蒸干(甲醇索氏提取),残渣用水饱和正丁醇溶解,转入分液漏斗中,1%氢氧化钠处理,蒸干,甲醇定容。

1.1.6 样品[7](颗粒剂) 研细,甲醇索氏提取,残渣加水溶解,乙醚脱脂,水层正丁醇提取,加1%磷酸二氢钾水溶液洗涤,正丁醇层减压浓缩至干。残渣用水溶解,乙醚洗涤,水层蒸干,甲醇定容。

1.1.7 样品[8](颗粒剂) 研细,甲醇索氏提取,残渣加水,微热使溶解,正丁醇提取,氨试液洗涤,正丁醇液蒸干,残渣加水使溶解,通过D101型大孔树脂,先后以水、40%乙醇、70%乙醇洗脱,收集70%乙醇洗脱液,蒸干,残渣加甲醇溶解,加于中性氧化铝柱上,先后用甲醇、40%甲醇洗脱,收集40%甲醇洗脱液,蒸干,甲醇定容。

1.1.8 样品[9](黄芪提取物) 加水溶解后上D101大孔树脂柱,收集70%乙醇洗脱液,挥去乙醇后,转移至分液漏斗中,正丁醇提取,氨试液洗涤,正丁醇层蒸干,甲醇定容。

1.1.9 样品[10](黄芪药材) 水提取,提取液加甲醇醇沉多糖,滤过,回收甲醇至干,残渣加少量水使溶解,乙醚脱脂,正丁醇提取,正丁醇液蒸干,残渣加少量乙醇溶解,均匀洒在装有干燥Al2O3∶MgO(36∶9)混合物的G3漏斗中,用75%乙醇洗脱,洗脱液回收乙醇,蒸干,残渣用95%乙醇溶解,乙醇液中加入大量乙醚,抽滤,滤渣自然挥干乙醚,将滤纸浸于甲醇中使滤渣充分溶解,弃去滤纸,定容。

综合上述样品提取纯化方法,制定基本纯化流程如下,如果样品中干扰仍较大,则可以参考前述通过大孔树脂柱或氧化铝柱的处理方法:

1.2 衍生化 由于黄芪甲苷只在紫外末端有最大吸收(结构见Fig.2),而且含量一般比较低,含量测定时影响准确性及检出限,采取适当的方法对其进行衍生化加以改善。

1.2.1 姚美村[1] 等以吡啶 苯甲酰氯(2.5∶1)为衍生化试剂,对黄芪甲苷分子中的羟基进行

苯甲酰化,样品经甲醇索氏提取,提取液减压蒸干,残渣加水饱和正丁醇溶解,1%氢氧化钠提取3次,正丁醇层用正丁醇饱和的水洗2次,正丁醇层蒸干,残渣加吡啶溶解,加入氯仿,在冰浴下加入苯甲酰氯,摇匀后冰箱放置24h,挥干溶剂,残渣加入内标储液,用甲醇溶解并定容。

1.2.2 样品[11](胶囊剂) 经1%醇制氢氧化钾回流,提取液水浴蒸干,残渣用水溶解,水溶液经乙醚脱脂后,用水饱和正丁醇提取,合并正丁醇提取液,以1%磷酸二氢钾洗涤,正丁醇层蒸干,残渣用90%甲醇溶解并定容。或者样品[12](黄芪及制剂)加2%氢氧化钾的甲醇溶液回流提取3次,提取液蒸干,残渣用水溶解,置分液漏斗中,加氯仿 正丁醇(2∶1)提取4次,提取液蒸干,残渣甲醇溶解定容。以上样品用醇制氢氧化钾皂化,使环黄芪醇类均转变为黄芪甲苷,所以本法测得的实际上是环黄芪醇类以黄芪甲苷计算的值。 2 色谱条件 2.1 流动相

2.1.1 乙腈 水 比例通常为:1∶2.5[3],30∶70[2],1∶2.3[6],31∶69[7],1∶2[13],35∶65[4,14],36∶64[9],40∶60[15]。

2.1.2 乙腈 磷酸水 乙腈 0.1%磷酸(33∶67)[16],乙腈 水 磷酸(1∶2∶0.1)[17],笔者曾测定复方制剂克尼胶囊中黄芪甲苷含量,流动相为乙腈 0.04%磷酸(35∶65),保留时间为11.3min。 2.1.3 甲醇 水 由于黄芪甲苷只在紫外末端有吸收,甲醇相对干扰较严重,使用比较少,多数为非紫外检测器检测时使用,常用比例为:甲醇[10],甲醇 水(75∶25)[12],甲醇 水(67∶33)[18],甲醇 水(50∶50)[5],40%甲醇[11]。

2.1.4 其他流动相 甲醇 四氢呋喃 水(90∶4∶6,0.2%三乙胺)[1](测定苯甲酰化的黄芪甲苷),乙腈 水 四氢呋喃(33∶67∶4)[19]。 2.2 检测器

2.2.1 紫外检测器(UVDetector),为最常使用的检测器,通常测定波长选用203nm,波长小,吸收强,干扰较大;而波长大,干扰小,吸收强度又较差,所以应根据实际需要选定检测波长。经过衍生化[1]的黄芪甲苷检测波长为230nm。2.2.2 示差折光检测器(refractiveindexdetector,RID) 流动相:甲醇 水(67∶33),流速1.0mL·min-1,示差折光检测[18]。

2.2.3 电喷雾质谱(electrosprayionizationmassspectrome try,ESI/MS)检测乙腈 水(40∶60)[15],流速0.5mL·min-1,柱温25℃,离子化方式:电喷雾离子化(ESl);选择性离子检测:黄芪甲苷807.5;传输电压90V;干燥气流速10.5L·min-1;雾化压力40psig;干燥气温度350℃;毛细管电压4000V。该检测方法灵敏度高,最低检出限10ng·mL-1,杂质干扰小,适用于生物样品的检测。

2.2.4 蒸发光检测器(EvaporativeLight scatteringDetector,ELSD),为一新型通用检测器,其信号响应与被测物的质量成正比,而不依赖于被测物的光学特性及官能团,理论上可用于挥发性低于流动相的任何组分的检测。它对无紫外吸收或为紫外末端吸收的物质如糖类、皂苷类、甾类等有较好的响应。田南卉等[12]以甲醇 水(75∶25)为流动相,流速1mL·min-1,检测器漂移管温度40℃,载气(空气)流速202.7kpa。吴永平等[9]以乙腈 水(36∶64)为流动相,ELSD参数:漂移管温度为105℃,N2流速为2.84mL·min-1。朱丹妮等[19]以乙腈 水 四氢呋喃(33∶67∶4)为流动相,流速1mL·min-1,漂移管温度105℃,N2流速2.82mL·min-1。李曼玲等[14]以乙腈 水(35∶65),漂移管温度:100℃,气体流速:2.65mL·min-1。赵灵芝等[20]以乙腈 水(36∶64)为流动相,流速0.8mL·min-1,漂移管温度:100℃,氮气流速为2.74mL·min-1。 3 讨论

HPLC分析速度快,方法比较简单,重现性好,是制剂质量控制的一种有力手段。样品要经过适当提取纯化过程,尽可能除去杂质而减少黄芪甲苷的损失。笔者经验表明用1%氢氧化钠水溶液洗涤效果较用氨水洗涤效果要好,杂质含量相对较少。