分子杂交原理及探针制备

分子杂交原理及探针制备

一、分子杂交基本原理

1953年，Watson和Crick提出了著名的DNA双螺旋结构学说。DNA这一线性的高分子化合物靠一些非共价键折迭形成三维空间构象。这些非共价键都是比较弱的键，易受外力的作用而断裂，导致空间构象的破坏，使有规则构型的DNA变成不规则的线团，此过程称为DNA变性。DNA变性时，维系双链的氢键也发生断裂而形成两条互补的单链DNA。引起核酸变性的因素有酸、碱、热、某些变性剂（如尿素、甲酰胺等）和某些有机溶剂都可引起DNA变性。 根据DNA变性的程度与温度的关系，可绘制融解曲线。变性的DNA达到总量1/2时的温度称为融解温度（Tm）。Tm值受溶液中离子的种类、离子强度、DNA中碱基组成的均一性以及G-C碱基对含量等因素的影响。

变性的DNA两条互补单链，在适当重新缔合成双链的过程为DNA复性或退火。复性后两条单链又重新按照碱基互补的原则结合起来，形成双螺旋结构，其理化性质和部分生物活性恢复。

两条DNA单链之间能否复性，并不取决于这两条链是否同源，而取决于它们的碱基序列是否互补。如果两条来源不同的DNA单链具有互补的碱基序列，也同样可以复性形成一个杂交体，这个过程即杂交，或称分子杂交。

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RNA的化学组成与DNA相似，也有碱基、戊糖和磷酸三种成分，所不同的是戊糖为核糖，碱基中尿嘧啶（U）代替胸腺嘧啶（T），其他三种碱基与DNA分子中的相同。分子杂交不仅可发生在两条DNA单链之间，而且也可发生在具有互补碱基的DNA和RNA片段之间，或RNA与RNA片段之间，即有DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。

分子杂交是在一定条件下以变性DNA或RNA单链作模板，另一DNA或RNA单股寡核苷酸与其碱基互补而生成杂交复合体的过程。 二、基因探针

探针广义上是指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子，例如抗原-抗体、生物素-亲和素等均可看成是探针与靶分子的相互作用。基因探针是指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记（同位素或非同位素标记）的核苷酸链。由于基因探针已与核酸样品中具有互补序列的核酸片段退火杂交。因此已广泛用于基因克隆筛选、酶切图谱制作、基因突变、DNA序列分析以及某些临床诊断等方面。 （一）基因探针种类和选择

基因探针是分子杂交中用于样品特定的DNA或mRNA序列定位的关键物质。根据来源与性质不同已分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、cRNA探针和人工合成

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的寡核苷酸探针等5类。选择探针的原则是要有高度特异性，其次也需考虑制备探针难易性和检测手段的灵敏性等其他因素。

2. 探针的选择

一般探针越长，杂交作用越强，其专一性也越强。但自动合成仪合成的探针最适长度常有一个上限，约为50bp。 三、基因探针标记方法 （一）、标记物

探针标记物有放射性同位素和非放射标记物两大类。 1. 放射性同位素

放射性特同位素标记物是目前应用最多的，因其灵敏度高，已标测到10-14~10-18g物质。此外放射性同位素与相应的元素具有完全相同的化学性质。因此对各种酶促反应无任何影响，且不会影响碱基配对的特异性、稳定性及杂交性质。由于标记探针具有放射性，故标记反应可用闪烁记数器监测；杂交信号用敏感性高的放射自显影技术标测，信号的强弱通过计数银粒的多少易于进行定量分析。主要缺点是射线对人体有伤害作用，操作时需要有一定 的防护措施，放射性物质需要特殊的处理以及常用放射性核素的半衰期短不宜存放使用。 2. 非放射性标记物

由于放射性同位素标记探针的局限性，人们一直在寻找

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非放射性标记物，目前常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）和生物素（biotin）。虽非放射性标记探针的敏感性不如同位素标记，但其稳定性和分辨率更高，且标测时间短、操作简便，不需特殊的防护设备，更重要的是不存在放射性污染。似有取代放射性同位素标记物的趋势。 三、标记法

探针标记法有酶反应法和化学反应法两大类，但以酶反应法较常用。 1. 切口平移法

切口平移标记法先由胰DNA酶I在DNA双链上随机切口，大肠杆菌DNA聚合酶I作用以切口处开始，以另一条DNA链为模板，以4种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解5’端核苷酸和3’端修复加入标记核苷酸同时进行，切口平行推移，可均一标记DNA链。 2. 引物延伸法

本法与切口平移法相似，都是利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新的DNA链。由于DNA聚合必须从具有3’-OH的末端开始合成，因此与切口平移不同，引物延伸法需要一段与模序列互补的寡聚核苷酸作引物，将它与模板杂交，以提供3’-OH端。 3. 末端标记法

末端标记法是将标记法导入线型DNA或RNA的5’端或3’端的一类标记法。

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