REALTIME PCR 步骤

REALTIME PCR 步骤

主要试剂

1. Trizol Invitrogen公司 2. 焦碳酸乙二酯（DEPC）水 碧云天生物技术有限公司 3. 三氯甲烷 4. 异丙醇 5. 无水乙醇

6. PCR试剂盒 Takara公司

实验方法

一. 子宫内膜组织总RNA提取

1. 组织破碎：将适量子宫内膜组织移入研磨器，每50-100mg组织中加入Trizol溶液1ml，彻底匀浆，使内膜组织完全裂解。

2. 均一化：将RNA裂解液由研磨器转移至离心管中，管盖密闭后，在涡旋震荡器上剧烈震荡1 min，室温放置5-10 min。

3. 分离：每毫升Ttrzol中加入氯仿200 μl，管盖密闭后，充分振摇30s，室温放置5-15 min。

4. 低温高速离心机4℃，12000转，离心15 min（注意：离心不超过12000转），离心结束后液体分可为三层。

5. 将含RNA的上层无色水相（约占液体总体积的50%-60%）加入新的1.5 ml离心管中。

6. 按每毫升Trizol加异丙醇0.5 ml 的比例加入异丙醇，管盖密闭后，上下颠倒混匀。

7. 在室温下放置5-10 min，使RNA充分沉淀。 8. 12000转低温（4℃）离心10 min。

9. 弃上清，按每毫升Trizol加入75%乙醇1 ml的比例洗涤RNA沉淀。 10. 7500转低温离心5 min，弃上清。 11. 重复洗涤RNA沉淀一次。

12. 室温适当干燥，除去残余乙醇（注意：RNA不可过于干燥，难于溶解）。 13. 用20-40 μl去RNA酶水溶解RNA沉淀。

二. 核酸蛋白分析仪测定各样本RNA的含量及纯度 1. 分别测定260 nm，280 nm处的吸光值(OD)。 2. 记录RNA的浓度读数。

3. RNA纯度的判定：RNA的纯度根据A260nm/A280nm比值判定：比值大于1.9说明纯度较高，小于1.6说明含有蛋白，介于1.6-1.9之间说明含有不同程度的DNA 。

三. 逆转录生成cDNA （1）逆转录反应体系 5×PrimeScript Buffer 2 μl PrimeScript Rt Enzyme Mix I 0.5 μl Oligo dT Primer 0.5 μl Random 6 0.5 μl

Total RNA 1 μl （<500ng） RNase Free dH2O up to 10 μl （2）逆转录反应条件 37℃ 15 min 逆转录反应 85℃ 5 s 逆转录酶失活反应 四. 实时荧光定量检测 （1）PCR引物序列 （2）PCR扩增体系

SYBR Premix Ex TaqTM II （2×） 10 μl PCR Forward Primer （10 μM） 0.8 μl

PCR Reverse Primer （10 μM） 0.8 μl ROX Reference Dye （50×） 0.4 μl RT产物 2 μl ddH2O 6 μl 总体积 20 μl （3）PCR反应条件

PCR反应条件为95℃预变性30 s；然后95℃ 15 s、60℃ 60 s共40个循环，并检测溶解曲线。