摘要：为了探索甘蓝型油菜的脂肪酸代谢调控机制，发掘出新的油脂代谢调控因子，本实验室从
构建的甘蓝型油菜种子不同发育时期特异性，筛选得到一个功能未知基因，命名为BnaA09。本研究在构建 pCAMBIA1300-psg-Cas9-A09沉默质粒的基础上，通过农杆菌介导转化甘蓝型油菜湘油15号，获得转基因植株, 并且对转基因植株BnaA09的表达情况进行检测,本研究对进一步揭示BnaA09基因的功能奠定很好的基础。
关键词：BnaA09基因；沉默质粒构建；农杆菌介导；油菜遗传转化
Abstract: In order to explore the regulatory mechanism of fatty acid metabolism in B.napus and
investigate new indicator of lipid metabolism. In this study, we isolated a function unknown gene from the SSH library of the specific expression gene of B.napus seeds at different developmental stages, named BnaA09. Based on the construction of pCAMBIA1300-psg-Cas9-A09 silencing plasmid, transgenic plants were obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Brassica napus XY15. The expression level of BnaA09 gene and the content of seed oil in the transgenic plants were both analized. Our research performed a good foundation for further revealing the function of BnaA09 gene.
Key words: BnaA09 gene; Construction of silencing plasmid; Genetic transformation of Brassica
napus; Agrobacterium-mediated
1 前言
1.1 研究目的和意义
本研究在构建pCAMBIA 1300-psg-Cas9-A09沉默质粒的基础上，利用农杆菌介导方法，对甘蓝型油菜湘油15号进行遗传转化，获得转基因植株[1]，对BnaA09基因进行沉默之后，推测BnaA09基因在种子油脂代谢途径中的功能，了解BnaA09基因在种子油脂代谢调控中的作用机理，为将来更深层次的研究种子油脂代谢途径与调控机理奠定基础。
1.2 油菜遗传转化的研究现状
我国油料作物种植历史悠久，最早可追溯到秦汉时期[2]，油菜作为重要油料作物，也是我国优势油料作物，在我国的种植面积广阔，其种植面积和产量约占世界30%[3]，但目
1
前我国多种油料作物产量达到瓶颈，需求主要依赖进口[4]，自给自足困难，既然产量难提高，那就应该注重食用菜籽油的质量 ，因此，提高油菜种子的油脂含量和改善菜籽油的品质一直是我国油菜育种的首要任务。
培育优良油菜品种，满足社会各方面生产要求，具有重大意义。迄今为止,通过常规育种技术的运用，油菜作物品种的改良虽取得一定的成效，但同时还存在着育种年限长、工作量大、及亲本材料缺乏等问题,为理想品种的选育增加了很大的困难[5]。近年来，现代分子生物技术迅猛发展，转基因技术更是发展飞快，已有多达十种方法成功运用于植物中。油菜是最早一批从中受益的作物，自1986年人类获得第一例转基因油菜，油菜的转基因研究飞速发展，人们也越来越重视植物转基因工程技术[6]。利用基因技术对油菜进行转化，使得油菜在抗逆性、品质和产量等方面均得到了明显改善。在世界各地，已有多种转基因油菜品种大面积的投入农业生产实践。
转基因技术的迅速发展为油菜遗传改良开辟了新的路径。目前应用较广泛的植物遗传转化方法主要有农杆菌介导转化法、电击法、花粉管通道法、显微注射法、基因枪法、PEG介导法、离子束介导法、激光微刺穿孔法等方法[7]。其中农杆菌介导法以其成本低、拷贝数低、重复性好、易操作、基因沉默现象少，且转育周期短等优点而深受科研工作者的喜爱，是最受欢迎的转化方法[8]。农杆菌介导法主要以植物的分生组织为受体,导入外源基因，通过真空渗透法或农杆菌浸泡，使农杆菌与受体材料接触完成可遗传细胞的转化，并通过加入抗生素进行转化体的筛选，使转化细胞再生为植株，分子检测鉴定转基因植株后代[9]。但目前油菜转化效率普遍较低，不利于转基因技术在油菜育种上的普遍使用，所以提高转化效率仍旧是油菜遗传转化工作的重点。对于油菜，下胚轴和子叶柄容易再生，所以是转化受体的最佳选择[10]。其中，下胚轴具有更多的优点，像取材容易、分化频率较高、不受时间限制和易被农杆菌感染等，而成为最理想的再生和遗传转化外植体[11]。
1.3 CRISPR/Cas9技术的研究进展
1.3.1 CRISPR/Cas9技术的简介
CRISPR /Cas 系统是一种适应性免疫防御系统，广泛存在于细菌与古细菌中，用来抵御外来质粒DNA或噬菌体的入侵[12]，大约40%的细菌和90%的古细菌体内存在CRISPR基因座[13]。CRISPR /Cas 系统类型多样，根据 Cas 蛋白组分及氨基酸序列不同， CRISPR/Cas 系统可以分为3种类型，Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型[14]。Ⅰ型和Ⅲ型 CRISPR/Cas 系统较为复杂，而Ⅱ型的组成较简单，以 Cas9 蛋白及导向 RNA 为核心组份，即为目前广
2
泛应用于基因组定向编辑的CRISPR/Cas9系统。CRISPR/Cas9系统是目前在基因组编辑范围内最受欢迎的新方法，该系统通过人工设计特异性向导 RNA序列与靶序列进行碱基配对，引导 Cas9蛋白结合到靶序列处，对 DNA 进行定点切割，然后利用细胞的同源重组修复机制或非同源性末端连接对断裂的 DNA 进行插入、修复、缺失或替换 [15]。 1.3.2 CRISPR/Cas9技术的应用
CRISPR/Cas9 技术体系首先是在人类与动物细胞系中建立，随后经过人工改造的 CRISPR/Cas9 系统快速应用于拟南芥、小麦、水稻、烟草、玉米等不同植物基因组的定向编辑研究中[16]。除了在动植物基因组方面的研究，CRISPR/Cas9系统介导的基因组定向编辑技术在生物医学和生物工程方面也有广泛的应用[17]。例如：快速建立基因突变的动物或细胞模型、作为新的作物育种技术、利用基因组编辑功能改造细菌细胞工厂[18]。此外，CRISPR/Cas9 系统除了用于基因组定向编辑外，还可应用于基因组规模的功能筛选、特定染色体位点的标记以及内源基因的转录与表观遗传调控等[17]。 1.3.3 CRISPR/Cas9技术的优势及缺点
CRISPR/Cas9系统被称为第三代基因组定向编辑技术，与ZFNs和TALENs系统相比，它有一个很大的优势，即可以实现同时对基因组中多个靶基因进行编辑，从而可以用来修饰编辑同一代谢途径中的不同调控基因或同一基因家族中的不同成员[16]。相比之下，还有其他优点：更简便的操作性，成本低廉，基因编辑效率更高[19]。
尽管CRISPR/Cas9系统被看做是一种高效的基因编辑技术，但也无法改变和其他基因编辑技术一样有着明显缺陷的事实，脱靶效应。研究发现，设计的导向RNA 会与非靶点DNA 序列错配，引入非预期的基因突变，即脱靶效应[20]，脱靶效应会引起基因突变，基因重排或者基因删除，重则导致细胞死亡[21]，这个缺点严重制约了 CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛使用。所以在实际的应用中，脱靶效应必须能够可控。
1.4 SSH文库简介
本实验利用抑制消减杂交技术构建了甘蓝型油菜湘油15种子特异表达基因的SSH文库，SSH技术又叫抑制消减杂交技术，是一种简单、快速分离差异基因的方法，该方法的基本原理是将消减杂交技术与抑制PCR相结合，以抑制PCR为基础，利用链内退火优于链间退火，使非目的序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生“锅柄样”结构，无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目的序列片段的扩增[22]，消减杂交技术则是根据杂交二级动力学原理，丰度高的单链cDNA退火时产生的同源杂交速度快于丰度低的单链cDNA，保证丰度低的cDNA不会丢失，丰度高的cDNA不会过度分离，从而使丰度上有差别的单
3
链cDNA相对含量基本一致，使得杂交后基本消除目的基因间的丰度差异,同时也富集了差异表达基因，这样既利用了消减杂交技术的消减富集，又利用了抑制PCR技术进行高效的动力学富集[23]。
目前，用于分离基因表达差异的方法包括mRNA差异显示PCR、抑制消减杂交技术（SSH）、基因表达系列分析( SAGE)、杂交和基因芯片技术等。其中SSH技术在动植物及微生物领域中有广泛的应用[24]。
SSH技术的最大优点是降低了假阳性率，具有高度敏感的特点，能使低丰表达的度cDNA也有可能被检出，还具有背景低、重复性强等优点。同时SSH也存在许多不足，需要起始材料较多，过多依赖PCR技术，并且SSH技术得到的cDNA是限制酶消化的cDNA，不是全长cDNA。而且材料间差异不能过大，不能同时对多个材料之间进行比较，材料之间存在过多的差异及小片段缺失也不能有效被检测[25]。在植物领域内,SSH技术特别适合于研究发育阶段转型前后,个体内不同器官之间,以及受环境影响较大的差异表达基因和克隆。
1.5 BnaA09的研究进展
本研究从本实验室前期研究所构建的甘蓝型油菜“湘油15”种子不同发育时期特异性表达基因的SSH文库[26]当中，筛选得到一个功能未知基因，命名为BnaA09。研究证实，
BnaA09在开花后25天至30天的种子中有表达，这个阶段是种子胚发育与油脂积累的关键时期，说明BnaA09很有可能会对甘蓝型油菜种子的油脂代谢有影响。但是其具体功能还不明确，所以构建沉默质粒对其进行转化再进一步研究该基因表达与否会不会影响油菜的油脂含量。故实验室构建了pCAMBIA1300-psg-Cas9-A09沉默质粒，希望通过油菜转化获得该质粒的转基因株系，对BnaA09基因进行沉默，为进一步研究BnaA09基因的具体功能奠定基础。
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 转化受体
实验材料甘蓝型油菜品种（品系）湘油15号。由表观遗传与脂肪酸代谢调控实验室提供。 2.1.2 转化载体
以植物双元表达载体pCAMBIA 1300 为基础构建pCAMBIA 1300-psg-Cas9-A09质粒
2.2 实验地点
4
相关推荐：
loading