湖南农业大学生命科学楼，油菜种植在组培室中进行，保证油菜光，温，水等生长条件。
2.3 培养基
YEB培养基、M0培养基（种子萌芽）、DM悬菌培养基、M1培养基（共培养）、M2培养基（诱导愈伤组织）、M3培养基（愈伤组织再分化）、M4培养基（诱导生根）
表1 YEB培养基配方
Table 1 Medium components of YEB medium
培养基成分 蛋白胨 酵母提取物 牛肉浸膏 MgSO4·7H2O 琼脂粉(固体培养基）
表2 遗传转化各阶段培养基配方
Table 2 Components of medium used by different stages of transformation 培养基 种子萌发培养基 悬菌培养液 共培培养基 筛选培养基 分化培养基 生根培养基
培养基简称 M0 培养基 DM 培养基 M1培养基 M2培养基 M3培养基 M4培养基
配方 1/2MS +12g/L agar
MS+30g/L sucrose+100μm AS
MS+30g/Lsucrose+18g/LManitol+2,4-D+Kinetin+100
μm AS +10g/L agar
MS+30g/Lsucrose+18g/LManitol+2,4-D+Kinetin
+10g/Lagar+ Hyg+ Cb+AgNO3 MS+10g/LGlucose+0.25g/LXylose+0.6g/LMES
+IAA+10g/LAgar+ Hyg+Cb+Zeatin MS+10g/Lsucrose +Cb+12g/Lagar
pH 5.8 5.8 5.8 5.8 5.8
质量 5g 1g 5g 0.493 g 15g
2.4 实验仪器及用具
磁力搅拌器、干燥箱、无菌操作台、组织培养室、生物安全柜、摇床、平板、三角瓶、酒精灯、烧杯、镊子、刀、玻璃棒、移液枪、EP管、离心机、水浴锅、研磨棒、PCR仪、高压灭菌锅、电泳仪、分析天平等
2.5 其他材料
5
75%酒精、0.1%升汞、吐温、超纯水、乙酰丁香酮、蛭石、CTAB、氯仿异戊醇、冰乙醇、琼脂糖、EDTA、TAE、溴化乙锭（EB）等
2.6 实验设计
2.6.1 划平板
在无菌操作台中，用接种环挑取农杆菌在YEB固体培养基平板划线，胶带密封，放入冰箱保存。
2.6.2 甘蓝型油菜“湘油15”的播种
(1)取适量种子于灭过菌的三角瓶中，加入75%酒精，没过种子即可，摇晃30s，时间不宜超过一分钟，弃液。
(2)加入适量0.1%HgCl2(约20ml)和1-2滴吐温，摇晃起泡后静置20min。完毕后倒入弃液瓶。
(3)用灭菌纯水将种子清洗4-5次，洗至无泡沫后，加适量灭菌纯水静置60min，弃液。 (4)用无菌镊子将种子平铺于M0培养基表面，每瓶25粒左右，均匀分散。
(5)将铺好种子的三角瓶放入240C暗室培养6d。不宜超过六天。（等苗长到1cm时开始摇菌） 2.6.3 摇菌
(1)小摇：取10mlYEB培养基至三角瓶中，再加入10μl卡那霉素（K50）、10μl链霉素（Str）、20μl利福平（Rif，棕色），用牙签挑取单个菌落放入三角瓶中，将三角瓶放入280C摇床培养两天。
(2)大摇：扩大培养，按比例将YEB培养基加至50ml，小摇时加入的三种抗生素依次按比例扩大加入，摇床培养12h左右。 2.6.4 外植体的制备和侵染
(1) 用无菌镊子将暗培养6d的幼苗取出放入灭好菌的大培养皿中，倒入适量DM培养基保湿。
(2) 用无菌镊子和解剖刀切取下胚轴，每个长度为0.8-1cm，这期间注意下胚轴需浸泡在DM培养基中，然后将切好的下胚轴转入三角瓶中。
(3) 在切取下胚轴时，将培养好的菌株4000rpm离心15min，弃上清液。用少于50ml（30-35ml）的DM培养基重悬，将重悬后的菌在放入280C摇床培养30min-1h。然后将准备好的菌液倒入装有下胚轴的三角瓶，侵染30min。
(4) 侵染完毕后，将下胚轴转至放有灭菌滤纸的空培养皿中，滤干，在超净工作台吹
6
5-10min，以除去多余农杆菌。 2.6.5 下胚轴与农杆菌共培养
将沥干的下胚轴转到M1培养基中，注意保持外植体与培养基充分接触，胶带密封。放入240C培养室暗培养40-48h（灵活处理，根据菌的生长情况和外植体的状况而定，如果在外植体周围看到很明显的白色（菌），立即将外植体转出）。 2.6.6 初步诱导筛选
共培48h后，将M1培养基上的外植体转到诱导培养基M2中，置于组织培养室 （240C，长日照光照（16/8h）），培养三周。 2.6.7 愈伤组织再生
三周后将外植体转入M3培养基中，每2周继代一次，前面两次继代时不要轻易放弃外植体，如继代到三至四次时还没有分化出愈伤组织的下胚轴就丢弃，出现绿芽的下胚轴就可以进行下一步的培养，转入生根培养基。 2.6.8 生根培养及炼苗
在M3培养基上生长出来的分化芽，切取长出两片叶的芽点，放入M4培养基中，培养一个月，待长出4-5片叶子，且长出根后即可移入小花钵中练苗生长。 2.6.9 提取DNA
(1) 取少量抗性苗最新长出的嫩叶组织（＜500mg）放入EP管中，将EP管放入液氮速冻1min，使用研磨棒将幼叶组织快速磨碎。加入600μl已加热的CTAB[27]缓冲液并用研磨棒研磨使磨碎的组织和缓冲液充分混合。
(2)把EP管插入漂浮板，在65℃水浴锅中水浴15min左右，其中注意颠倒混匀1-2次，使混合液受热均匀。
(3)水浴完成后向EP管中再加入600μl氯仿异戊醇，振荡至混合液发白。 (2)将EP管放入离心机，在16℃下12000rpm离心10min。
(3)取上清液500μl于EP管中，加入800μl-20℃保存的冰乙醇，上下摇匀。 (4)放入-20℃的冰箱内,20min后取出重复步骤(2)。 (5)弃上清液，加入500μl75%的乙醇，振荡摇匀。 (6)将EP管放入离心机，在16℃下12000rpm离心5min。 (7)弃上清液，风干后加入30μl超纯水溶解DNA，轻弹混匀。 2.6.10 PCR扩增
采用PCR[28]法进行DNA扩增，必须有DNA模板、DNA聚合酶、DNA引物、4种NTP混合物和Mg2+。抗性苗幼叶DNA作为模板，pCAMBIA 1300-psg-Cas9-A09的抗性苗
7
以35S作正向引物，BnaA09基因的反向引物为检测的反向引物进行PCR。PCR反应体系及反应参数见表3和表4，反应循环数为28。
表3 PCR的反应体系 Table 3 System of colony PCR
试剂 Tag DNA聚合酶
上游引物 下游引物 DNA模板 无菌水 总体积
表4 PCR的反应参数
Table 4 Reaction parameters of PCR
反应步骤 预变性 变性 褪火 延伸 终延伸
温度 94℃ 94℃ 58℃ 72℃ 72℃
时间 4min 40s 40s 30s 7min
用量 7.5μL 0.5μL 0.5μL 1μL 5.5μL 15μL
2.6.11 琼脂糖凝胶电泳
(1)在分析天平上称取0.6g琼脂糖，溶解于40mlTAE缓冲液中，放入微波炉中加热至完全溶化，取出摇匀。
(2) 再冷却到约60℃，加入1μl溴化乙锭（EB），摇匀。
(3)用胶带封好制胶板两端，插入适当梳子，再将溶解的琼脂糖倒入，室温冷却凝固，大约30min。
(4)把凝固的琼脂糖胶放入电泳槽中，将DNA样品与加样缓冲液按4：1混匀后，用微量
8
相关推荐：
loading