病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离.②cDNA 基因文库的筛选比较简单易行.③每一个cDNA 克隆都含有一种mRNA 序列,这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低,由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因.④cDNA 克隆可用于在细菌中能进行表达的基因克隆,直接应用于基因工程操作.⑤cDNA 克隆还可用于真核细胞mRNA 的结构和功能研究.缺点:①cDNA 文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA 文库,并且受细胞来源或发育时期的影响.②cDNA 基因文库不能直接获得基因的内含子序列和基因编码区外大量的调控序列的结构与功能方面的信息.③在cDNA 基因文库中,对于低丰度mRNA 的cDNA 克隆所占的比例则比较低,且分离也就比较困难
10.抗除草剂植物作用机制:磷丝菌素食一种除草剂,可抑制植物谷氨酰胺合成酶的活性,发生致死性累计,bar基因编码磷丝菌素乙酰转移酶,使磷丝菌素乙酰化而失去毒性,抗除草剂植物可以导入bar基因,可以破坏磷丝菌素的活性,而达到抗除草剂的作用.另一种方法,可以采用认为措施使植物谷氨酰胺合成酶基因的活性提高,而大量表达谷氨酰胺合成酶,使磷丝菌素无法抑制住大量的谷氨酰胺合成酶的活性,而达到抗除草剂的作用.
11．碱变性抽提法提取质粒DNA 的基本原理是:碱变性抽提法是基于染色体DNA 与质粒DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的.在pH 高达12.6 的碱性条件下,染色体DNA 的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性,质粒DNA 的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离.当以pH4.8 的NaAc 高盐缓冲液调节其pH 至中性时,变性的质粒DNA 又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA 不能复性而形成缠连的网状结构.通过离心,染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去.12.PCR 引物设计时需要注意哪些基本原则:①引物长度以20～30bp 为宜,过长过短都会降低特异性,而且过长会增加成本.②引物碱基要随机分布,避免出现嘌呤或嘧啶堆积现象,G+C 含量为45～55%左右.③引物内部不应含有回文结构,两个引物之间尤其是3`端不应有互补链存在.④引物的碱基顺序不应与非扩增区有同源性.⑤引物3`末端碱基原则上要求与模板DNA 配对.⑥引物5`末端允许有几个碱基不与模板DNA 匹配而呈游离状态,这不影响扩增的特异性.⑦引物的5`端一般加有适当限制性核酸内切酶的识别序列,便于克隆和表达,但其保护碱基有一定的要求.
13.T4 DNA 连接酶作用机制及提高平末端连接效率的方法:T4 DNA 连接酶的作用机制:①ATP+DNA ligase(E)→ E-AMP+PPi.②E-AMP 上的AMP 转移到DNA 的5′磷酸根上,使其活化,释放出酶.③活化的5′磷酸根与相邻的3′羟基形成3′,5′-磷酸二酯键,并释放出AMP.提高平头末端连接效率的方法包括:①加大连接酶用量(10 倍大于粘性末端的连接).②加大平头末端底物的浓度,增加分子间碰撞机会.③加入10%PEG8000,促进大分子之间的有效作用.④加入单价阳离子(NaCl),最终浓度150-200 mmol/L.
14.简述PCR 技术的基本原理:①变性:通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂,双链解离形成单链DNA.②退火: 当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂得多,而且反应体系中引物DNA 量大大多于模板DNA,使引物和其互补的模板在局部形成杂交链,而模板DNA 双链之间到互补的机会少.③延伸:在DNA 聚合酶和4 种脱氧核糖核苷酸底物及Mg2+存在条件下,5`→3`的聚.合酶催化以引物为起点的DNA 链延伸反应.以上3 步为一个循环,每一循环的产物可以作为下一个循环的模板, 数小时后, 介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制,数量可达2×106-7 拷贝.
15.简述影响Ⅱ型限制性核酸内切酶活性的因素有:①DNA 样品的纯度:DNA 样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性.可采用以下方法,提高酶活性:加大酶的用量,1μg DNA 用10U 酶、加大反应总体积、延长反应时间.②DNA 样品的甲基化程度:采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA,可防止DNA的甲基化.③ 酶切反应的温度:多数标准反应温度是37℃,如SmaI 为25℃或30℃ ,SfiI 为50℃ .反应温度过度或过低都会影响酶活性,甚至导致酶失活.④DNA 分子结构:某些酶切割超螺旋质粒DNA 时,酶量比切割线性DNA 时高出多位,可高达20 倍.⑤核酸内切酶的缓冲液:高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH 值等,会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性,即所谓的“星活性”现象. 16.简述琼脂糖凝胶电泳的基本原理:DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应.DNA 分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷,在电场中向正极移动.由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA 几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动.在一定的电场强度下,DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA 分子本身的大小和构型. 在琼脂糖凝胶电泳中,DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系.质粒DNA 样品用单一切点的酶切后与已知相对分子质量大小的标准DNA 片段进行电泳对照,观察其迁移距离,就可获知该样品的相对分子质量大小.凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA,也可以鉴别相对分子质量相同但构型不同的DNA 分子.另外在制备琼脂糖凝胶时加入溴化乙锭指示剂,溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光.当DNA 样品在琼脂糖凝胶中电泳时,琼脂糖凝胶中的EB 就插入DNA 分子中形成荧光络合物,使DNA 发射的荧光增强几十倍.荧光的强度正比于DNA 的含量,如将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对照,就可比较出待测样品的浓度.若用薄层分析扫描仪检测,只需要5～lOng DNA,就可以从照片上比较鉴别.如用肉眼观察,可
检测到0.01～0.1μg 的DNA. 12．什么是限制性内切核酸酶的星号活性?受哪些因素影响:Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性,但是这种特异性受特定条件的限制,即在一定环境条件下表现出来的特异性.条件的改变,限制酶的特异性就会松动,识别的序列和切割都有一些改变,改变后的活性通常称第二活性,而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示,因此第二活性又称为星活性.概括起来,诱发星活性的因素有如下几种:(1)高甘油含量＞5％,v／v);(2)限制性内切核酸酶用量过高(>100U／μg DNA);(3)低离子强度(<25 mmol／L);(4)高pH(8.0 以上);(5)含有有机溶剂,如DMSO,乙醇等;6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+,Cu2+,C02+,Zn2+等).
17.简述Sanger 双脱氧链终止法的基本原理:在模板指导下,DNA 聚合酶不断将dNTP 加到引物的3?-OH 末端?使引物延长?合成出新的互补的DNA 链.如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP),由于双脱氧核糖的3?位置上缺少一个羟基,故不能同后续的dNTP 形成磷酸二酯键,即形成一种全部具有相同5?-引物端和以ddNMP 残基为3?端结尾的一系列长短不一片段的混合物.由于双脱氧核苷酸在每个DNA 分子中掺入的位置不同,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸单链DNA,从而读取DNA 核苷酸序列.18．什么是细菌的限制—修饰系统?有什么意义:细菌中有作用于同一DNA 的两种酶,即分解DNA 的限制酶和改变DNA 碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶.而且,这两种酶作用于同一DNA 的相同部位,把这两种酶所组成的系统称为限制与修饰系统.不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统.修饰的本质是通过甲基化酶将DNA 中某些碱基进行甲基化修饰,由于宿主自身DNA 上的这些位点进行了修饰,限制酶就不能进行切割.由于外来的DNA 在相应的碱基上没有被甲基化,宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我,并将人侵的外来DNA 分子降解掉.所以DNA 限制作用和修饰作用为细胞提供了保护.
选择或填空6.基因克隆的目的是(获得目的基因片断),常用的方法有(功能克隆)、(表型克隆)和(定位克隆)等7.基因克隆的本质是(从文库中筛选目标基因;),重点是(“筛选”).8.构建 基因文库时,应根据所要分离的外源基因的大小选择合 适的载体,这些载体通常包含有 λ 噬菌体、YAC 以及(粘粒/cosmid)、(BAC/细菌人工染色体)和(质粒/plasmid)等.9.根据构建方法的不同,基因文库分为基因组文库.cDNA文库等.在下列文库中有(D)是cDNA文库.A.YAC文库 B.BAC文库 C.MAC文库 D.扣减文库1.(记住名称)RFLP:限制性片段长度多态性 RACE:cDNA末端快速扩增 RDA:抑制性消减杂交 SSH:代表性差异分析技术 RAP-PCR:RNA任意引物PCR.2．为了使YAC载体能满足自主复制、保证染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要,构建YAC时必须含有端粒重复序列(TEL)、着丝粒(CEN)和自主复制序列(ARS).3.哺乳动物的载体所选择的基因有选择基因、抗性基因4.构建基因文库时,应根据所要分离的外源基因的大小选择合适的载体,这些载体通常包含有λ噬菌体、YAC以及BAC、质粒和粘粒等.5.环丝氨酸富集法(tet r基因插入失活):Tet只抑制蛋白质合成,抑制细菌的生长而不杀死细菌.6.southern杂交:检测DNA nouthern杂交:检测RNA 。原位杂交:检测DNA或RNA western杂交:检测蛋白质7.常用的诱变方法有盒式诱变、寡核苷酸介导的定点诱变和PCR介导的定点诱变.
9.构建基因文库是早期基因分离的方法.这种方法又可分为基因组文库和cDNA文库.质粒作为载体建文库时,需用同种限制性内切酶进行酶切10.核酸杂交检测法:菌落原位杂交,southern杂交,northern杂交,western杂交.11.平末端连接常采用同聚物加尾法、衔接物连接法和DNA接头连接法.12. 农杆菌介导法:利用农杆菌T-DNA可自动转移并整合到植物细胞基因组中的特性,将外源目的基因导入植物细胞的方法.13. 花粉管通道法:可避免植物组织培养步骤.14.胚胎干细胞法:优点是通过同源重组构建的转染能够进行打靶即在体外就能确定整合的位点,克服了显微注射无法解决的随机整合问题15.pBR322质粒具有编码tetr和ampr16.基因表达的调控元件包括启动子、增强子、沉默子、终止子和衰减子18.报告基因主要起报告和识别作用,它的表达产物对受体细胞无毒性,可反映外源基因在受体细胞中的表达水平.植物表达载体中常用的报告基因有:冠瘿碱合成酶基因、gus、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因.19.表达载体和受体细胞共同组成了外源基因的表达系统.1.两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒不相溶出现这种现象的原因主要是它们常常共用同一复制系统.2.限制性内切酶和DNA连接酶的发现、载体的使用以及大肠杆菌转化体子的建立是基因工程诞生的三大技术基础.3.为了使YAC载体能够满足自主复制、保证染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要.构建YAC时必须含有着丝粒、端粒重复序列、自主复制序列.4.用Taq DNA聚合酶得到的PCR产物不是平末端,而是有一个突出碱基A末端的双链DNA分子,根据这一现象设计提高克隆PCR产物的T载体.5.聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用来分析小分子
量的单链核酸,如RNA、核酸甘酸、DNA序列分析等.具变性条件可用加热,方式或使用尿素等变性剂.6.世界上第一例转基因动物是1981年美国人将大鼠的生长激素基因成功导入小鼠后获得的超级鼠;1983年,由Ti质粒介导的转基因烟草获得成功则标志着转基因植物诞生;
1986年,首批转基因植物——抗虫和抗除草剂棉花进入田间试验.7.限制性内切酶HpaⅡ和MspⅠ有共同的靶序列C↓CGC,所以它们是一对同裂酶;而BamHⅠ、BclⅠ、BglⅠ、BglⅠ、XhoⅠ则是一组同尾酶,因为它们切割DNA之后都可以形成由-GATC-4个核苷酸组成的粘性末端.8.构建基因文库时,应根据所要分离的外源基因的大小选择合适的载体,这些载体通过常包含有γ噬菌体、YAC以及质粒、噬菌体和粘粒等.
9．质粒在宿主细胞内复制形式一般分为严谨型和松散型,其中,以松散型方式复制的质粒在宿主细胞内的拷贝数较高,但稳定性较低;相反,以严谨型方式复制的质粒在宿主细胞内拷贝数较低,但稳定性好.
10.测序酶是经过修饰过的T7噬菌体DNA聚合酶,是采用缺失的方法,从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸,这样使得T7DNA聚合酶完全失去了3′-5′外切酶活性,只有5′-3′聚合酶活性,而且聚合能力提高了3~9倍,测序时常用此酶.11.基因芯片由于具有微型化、自动化和网络化三个特点而同时定量或定性地检测成千上万的基因信息.13.在DNA的分离操作中,往往利用DNA可溶于水而不溶于有机溶剂的特点,一般采用等体积的异丙醇或2体积的无水酒精将DNA沉淀下来.14.标记基因分为选择标记基因和筛选标记基因,其中,选择标记基因用于鉴别目标的DNA(载体)的存在,将成功转化了载体的宿主细胞挑选出来,而筛选标记是基因用于将携带外源DNA片段的重组子挑选出来.15.影响PCR的反应因素较多,其中引物的浓度一般为0.1~0.5umol／L,若引物浓度过高的话,一是容易引起错配和产生非特异性扩增,而是容易生成引物二聚体.1．随着基因工程技术的诞生和发展,人类可以通过细菌发酵、真核细胞培养和乳腺生物反应器等三种主要生产方式,大量取得过去只能从组织中提取的珍稀蛋白,用于研究或治病.2．Cohen 等在1973_年构建了第一个有功能的重组DNA 分子.3．基因工程的两个基本特点是:(1)分子水平上的操作;(2)细胞水平上的表达4．基因克隆中三个基本要点是:克隆基因的类型;受体的选择和载体的选择 5．克隆基因的主要目的有四点:(1)扩增DNA; (2)获得基因产物;(3)研究基因表达调控;(4)改良生物的遗传性6．完全的回文序列具有两个基本的特点,就是:(1)能够在中间划一个对称轴,两侧的序列两两对称互补配对;(2)两条互补链的5? 3?的序列组成相同,即将一条链旋转180°,则两条链重叠7.Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别4～6;个碱基,也有识别多序列的限制性内切核酸酶.根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析, 限制性内切核酸酶识别序列具有 GC倾向,即它们在识别序列中含量较高.8．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的,第一个大写字母取自属名的第一个字母.第二、第三两个字母取自种名的前两个字母,第四个字母则用表示株名.9．在酶切反应管加完各种反应物后,需要离心2 秒钟,其目的是混合均匀和防止部分酶切.10．第一个分离的限制性内切核酸酶是EcoK;而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是EcoRl.11．限制性内切核酸酶BsuRI 和HaeⅢ的来源不同,但识别的序列都是GGCC,它们属于异源同工酶.12．限制性内切核酸酶通常保存在浓度为50％的甘油溶液中.13．DNA 聚合酶I 的Klenow 大片段是用切割DNA 聚合酶I 得到的枯草杆菌蛋白酶,分子量为76kDa 的大片段,具有两种酶活性:(1) 5? -3?合成酶的活性;(2) 3?- 5?外切核酸酶的活性.14．反向转录酶除具有以DNA 和RNA 为模板合成DNA ,除了5?- 3?合成酶的活性外,还具有4 种酶的活性:(1) 5? -3?外切核酸酶活性;(2) 3?- 5?外切核酸酶活性;(3) DNA内切核酸酶的活性;(4)解旋酶的活性.15．RNA 连接酶作用时除了需要-SH和Mg2＋外,还需要ATP .16．反转录酶除了催化DNA 的合成外,还具有核酸水解酶H的作用,可以将DNA/RNA 杂种双链中的水解掉RNA.17．酚是蛋白变性剂,用酚抽提细胞DNA 时,具有两方面的作用:(1) 使蛋白质变性:(2)由于它能使蛋白质变性,故也能使核小体和核糖体解聚,释放出DNA 和RNA,提高DNA 的得率.18．用酚-氯仿抽提DNA 时,通常要在氯仿或酚-氯仿中加少许异戊醇.这是因为:异戊醇是一种有机试剂,可以降低表面张力,从而减少气泡产生.另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定. 19．用乙醇沉淀DNA 时,通常要在DNA 溶液中加入单价的阳离子,如NaCl 和NaAc,其目的是中和DNA 分子的负电荷,增加DNA 分子间的凝聚力.20．通常可在三种温度下保存DNA:4~5℃、-20℃、-70℃,其中以-70℃最好.21．在用SDS分离DNA时,要注意SDS的浓度,0.1％和1％的SDS的作用效果是不同的, 前者只将RNA 分离出来;,后者可将DNA 与RNA 一起分离出来.22．在DNA分离过程中造成DNA分子断裂的因素很多,主要有(1)核酸酶降解;(2)化学降解;(3)物理剪切.23．在分离DNA 时,要戴手套操作,原因是手上常有核酸酶.24．乙醇沉淀DNA的原理是乙醇使DNA 分子脱水.25. 基因工程中有3 种主要类型的载体:质粒DNA;病毒DNA;质粒和病毒DNA杂合体.26. 由于不同构型的DNA插入EB的量不同,它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同,SC DNA 的泳动速度最快,OC DNA泳动速度最慢_,L DNA 居中,通过凝胶电泳和EB 染色的方法可将不同构型的DNA 分别开来.
27. 就克隆一个基因(DNA片段)来说,最简单的质粒载体也必需包括三个部分:复制区: 含有复制起点;选择标记: 主要是抗性基因;克隆位点:便于外源DNA的插入.另外,一个理想的质粒载体必须具有低分子量.28. pBR322 是一种改造型的质粒,它的复制子来源于pMB 1,它的四环素抗性基因来自于__ pSCl01,它的氨苄青霉素抗性基因来自于pSF2124(R质粒).29.cDNA 技术是进行真核生物基因克隆的一种通用方法,因为它可以用mRNA 为模板,通过反转录合成一个双链的、无内含子的基因,因而有利于在原核细胞中进行功能表达.
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