选修1《生物技术实践》
第一部分 微生物的利用
实验1大肠杆菌的培养和分离
一、大肠杆菌
1．大肠杆菌属于革兰氏阴性细菌，为兼性厌氧的肠道杆菌。 2．用途：是基因工程技术中被广泛采用的工具。
二、本实验的内容是将大肠杆菌扩大培养和划线分离。分离后，一个菌体便会形成一个菌落，这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。
本实验用LB液体培养基（通用的细菌培养基）扩大培养大肠杆菌，培养后用LB固体平面培养基进行划线分离。 三、 细菌的培养和分离
1．细菌的培养：
（1）繁殖方式：细菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约20min分裂一次。
（2）培养的方法：需要将已有细菌的培养物转移到新的培养基中，一般用接种环来转移带菌的培养物。
2．细菌的分离 分离的方法与特点：
划线分离法：操作简单。（接种环）
涂布分离法：操作复杂，单菌落更易分开。（玻璃刮刀） 四、灭菌操作
1．灭菌操作的原因：获得纯净的培养物的关键是防止外来杂菌的入侵污染。 2．无菌操作的条件：
（1）各种器皿必须是无菌的。（首要条件） （2）各种培养基必须是无菌的。 “细菌喜荤，霉菌喜素”
细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制，还要加入一定量的氯化钠，以维持一定的渗透压。在中性偏碱的环境中生长（制备培养基时需调节培养基的酸碱度）。
霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。在中性偏酸的环境中生长（制备培养基时需调节培养基的酸碱度）。
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如果培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化，要用500g/cm2压力（90 ℃以上）灭菌30min. 3．灭菌的方法：是指杀灭病原微生物的方法。 （1）灼烧灭菌
（2）干热灭菌：160-170 ℃下加热1-2h。
（3）高压蒸气灭菌：100kPa、121 ℃(1kg/cm2)下维持15min.
（4）过滤灭菌：G6玻璃砂漏斗过滤（用于有些不能加热灭菌的化合物，如尿素加热会分解）
4．消毒的方法：是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽胞、孢子）的方法 （1）煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min
（2）巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min
（3）化学药剂消毒法：用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源 （4）紫外线消毒
五、大肠杆菌的培养和分离实验 1．实验步骤：
（1）培养基灭菌：将50mlLB液体培养基、50mlLB固体培养基加上封口膜和培养皿用牛皮纸包好
进行高压蒸汽灭菌。（封口膜的作用是既通气又不使菌进入）
（2）倒平板：将有培养基的三角瓶和培养皿放到超净台上，打开紫外灯和过滤风 （3）接种：接种环接种，在37℃振荡培养12h
（4）划线分离：在酒精灯火焰上灼烧接种环，接种环只在菌液中蘸菌液一次，然后在固体培养基
的平板上连续划线，盖好培养皿，将培养皿倒置，放在37℃恒温培养箱中培养12-24h，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落。
（5）菌种保存：用接种环取出单菌落，用划线法接种在斜面上，37℃培养24h后，置于4℃冰箱
中保存
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实验2分离以尿素为氮源的微生物
一、脲和脲酶
1．脲或称尿素，是蛋白质降解的产物。
2．脲酶：有些细菌可以尿素为氮源，这些细菌含有脲酶 （1）可降解尿素的酶
（2）作用原理：细菌合成的脲酶能将尿素分解成NH3，致使pH升高，使酚红指示剂变红。
二、实验设计及步骤 1．实验中的对照设置：
实验组：以全营养LB固体培养基进行培养（蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，琼脂糖，水） 对照组：以尿素固体培养基进行培养（葡萄糖，氯化钠，K2HPO4，酚红，琼脂糖，水） 加入通过G6玻璃漏斗过滤（使之无菌）的10ml尿素溶液（内含2g脲） 2．实验步骤：
（1）制备培养基：将已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基在酒精灯旁分别倒入两个培养皿
中，在水平的超净台上摇匀，平放至凝固。
（2）制备细胞悬液：用1g土样配制不同浓度的细胞悬液（加无菌水稀释）。
（3）用涂布分离法分离细菌：将不同浓度的土壤稀释液分别加入到有LB培养基和尿素培养基的
培养皿中，再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭。在酒精灯火焰旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。
（4）培养：倒置培养皿，在37℃恒温培养箱中培养24-48h （5）观察：培养基中的菌落数。
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实验4果汁中的果胶和果胶酶
一、果胶
1．化学组成：半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯
2．作用：（1）植物细胞壁的主要成分（2）将植物细胞粘合在一起（去掉果胶植物组织变得松散） 3．鉴别方法：果胶不溶于酒精 二、果胶酶
1．来源：黑曲霉、苹果青霉等微生物 2．作用：
3．应用：
（1）应用原理：水解果胶，使水果组织的分散性加大。 （2）果汁生产：提高出汁率和澄清度。 三、探究制作果汁的最佳条件 实验流程：
95%的乙醇用于检验是否有果胶
如果有浑浊（或者沉淀），说明果胶还没有被完全水解。 如果澄清，说明果胶被完全水解
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