方法

方法 2.1 细胞培养 2.1.1 细胞复苏

取出液氮冻存的乳腺癌MDA-MB-231和BT-549细胞株，迅速投入37℃水浴中快速融化；吸出细胞悬液移至15 ml离心管中，加入约10 ml RPMI-1640培养基，1000 rpm离心8 min，弃上清，将细胞沉淀用RPMI-1640完全培养基（含10%无支原体胎牛血清）重悬后转移至一次性细胞培养瓶内，补足培养基至6 ml，将细胞置于37℃含5% CO2 的细胞培养箱培养。 2.1.2 细胞换液

倒掉培养瓶内培养基，加入6 ml RPMI-1640完全培养基（含10%无支原体胎牛血清），置于37℃含5% CO2的细胞培养箱继续培养。 2.1.3 细胞传代

细胞处于80%~90%融合时进行传代，一般三天传代一次，倒掉培养瓶内培养液，向瓶内加胰酶细胞消化液2 ml，室温下把细胞培养瓶放在倒置显微镜下观察，待细胞形态变圆，细胞互相分散开后倒掉胰酶消化液，加入1 ml无支原体胎牛血清中和残留的胰酶，再加入3~4 ml RPMI-1640培养基，用一次性无菌巴氏吸管吹打细胞，使细胞从瓶壁完全脱离形成细胞悬液，将细胞悬液转入15 ml离心管，1000 rpm离心8 min，用RPMI-1640完全培养基（含10%无支原体胎牛血清）重悬细胞后分装到细胞培养瓶中，一般按1：3传代，补足培养基至6 ml左右，将细胞置于37℃含5% CO2的细胞培养箱继续培养。 2.1.4 细胞冻存

细胞处于80%~90%融合时进行冻存，细胞消化方法同前，将细胞悬液转入15 ml离心管，1000 rpm离心8 min，弃上清，加入4℃预冷的细胞冻存液（RPMI-1640培养基:无支原体胎牛血清:DMSO为6：3：1），分装到细胞冻存管中，每管1 ml，做好标记后放入4℃冰箱，1 h后转入-80℃冰柜，次日转入液氮

罐中保存。

2.2 细胞培养板接种细胞

细胞处于80%~90%融合时进行接种，细胞消化方法同前，倒置显微镜下用计数板计数细胞，按下式计算细胞密度：细胞密度=（四格细胞总数/4）×104（个/ml），将细胞悬液转入15 ml离心管，1000 rpm离心8 min，弃上清，加入足量的RPMI-1640完全培养基（含10%无支原体胎牛血清）重悬细胞，将细胞悬液接种到细胞培养板，置于37℃含5% CO2的细胞培养箱培养。 2.3 细胞转染（以6孔板为例）

1）细胞培养及接种培养板同前，待细胞处于约50%~70%融合时进行转染； 2）吸出培养板的培养液，每孔加入2 ml RPMI-1640培养基； 3）每个样本的转染复合物制备如下：

a. 用125 μl RPMI-1640培养基稀释小干扰1.25 μl，混合后室温下孵育5 min；

b. 用125 μl RPMI-1640培养基稀释稀释SilentFect Lipid Reagent转染试剂2.5 μl，混匀后室温下孵育5 min；

c. 将a与b混合，轻柔混匀，室温下孵育20 min；

4）每孔加入250 μl孵育好的转染复合物，前后左右轻柔摇动培养板，使板内的液体混合均匀；

5）将培养板放入37℃含5% CO2的细胞培养箱培养，4~6 h后换液，吸出培养基，每孔加入2 ml新鲜RPMI-1640完全培养基（含10%无支原体胎牛血清）。 2.4 CCK-8细胞增殖检测

1）细胞培养和6孔板细胞转染同前；

2）胰酶消化6孔板中的乳腺癌细胞，计数板计数，96孔板每孔铺5000个细胞（MDA-MB-231细胞）、3000个细胞（BT-549细胞）；每孔加10% FBS的RPMI-1640完全培养基100 μl，并设control siRNA对照组，四周加PBS液体防止水分蒸发；

3）置37℃、5% CO2培养箱中培养24、48、72、96 h；

4）24、48、72、96 h后弃去96孔板中旧的培养基，每孔加入无血清培养基100 μl，CCK-8溶液10 μl，混匀两种液体，避光操作；

5）放入培养箱中继续孵育0.5、1、2、4 h； 6）酶标仪测定OD值。 2.5 Western Blot 2.5.1总蛋白提取

1）室温下融解RIPA裂解液，混匀，取适量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1 mM；

2）取出细胞培养板，吸出培养基，每孔加入1 ml预冷的PBS漂洗1次，用移液器将PBS尽量吸干；

3）每孔加入100 μl RIPA裂解液，将细胞培养板水平置于冰上，水平摇床上摇30 min；

4）细胞充分裂解后，将溶胞产物转入1.5 ml离心管，4℃ 12000 rpm离心10 min；

5）将上清总蛋白转移至新的1.5 ml离心管，-80℃储存备用。 2.5.2 BCA法检测蛋白浓度

1）取1.2 ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准中，充分溶解后配制成25 mg/ml的蛋白标准溶液；

2）取适量蛋白标准液（25 mg/ml），用PBS稀释至终浓度为0.5 mg/ml的蛋白标准工作液；

3）按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B的比例配制适量BCA工作液，充分混匀；

4）将蛋白标准工作液按0，1，2，4，8，12，16，20 μl加到96孔板的标准品孔中，每孔加PBS补足体积至20 μl；

5）样品孔中每孔加入1 μl待测蛋白液和19 μl PBS；

6）每孔加入200 μl BCA工作液，37℃放置20~30 min； 7）酶标仪490 nm波长处检测蛋白浓度。 2.5.3 Western Blot实验

1）细胞培养、接种培养板及转染同前；

2）将各组蛋白原液用ddH2O稀释到同一浓度，加蛋白上样缓冲液混匀后加热煮沸5~10 min，成为蛋白上样液；

3）从-20℃冰柜取出蛋白分子量Marker，放在冰上缓慢融化；

4）装配凝胶板：将两块胶板（玻璃板）对齐，在水平桌面上固定于夹板中夹紧（使底面平齐，以防漏胶），垫上胶垫，将夹板垂直固定于胶架上，备灌胶；

5）配胶（先配分离胶，待分离胶凝固后再配浓缩胶）：

成分

Tris-HCl（1.5M, pH 8.9） Tris-HCl（0.5M, pH 6.8） Arc-Bis 10% SDS 40%蔗糖 ddH2O TEMED 10% AP

10%分离胶（ml） 15%分离胶（ml） 浓缩胶（ml）

2 0 2.67 0.08 0 3.25 0.004 0.04

2 0 4 0.08 0 1.92 0.004 0.04

0 1 0.53 0.04 1.2 1.23 0.004 0.02

6）灌胶：分离胶配好后同一方向摇8~10圈，充分混匀，避免形成气泡，然后立即用移液器沿玻璃板壁缓慢加入凝胶板，灌至绿框下约1~2 mm处停止，然后加ddH2O覆盖（以阻止空气中的氧对分离胶的氧化作用），注意观察，待看到水与分离胶之间出现一条明显分界线时，表示分离胶已凝固，再等5 min（期间配制浓缩胶），倒掉上层封水，并用滤纸吸干，将配好的浓缩胶加于分离胶之上，至胶板顶端1~2 mm处时，迅速将梳子水平插入，避免形成气泡，待浓缩胶凝固后，取下夹板；