第一章 基因工程
一、工具酶的发现和基因工程的诞生
1、基因工程的概念：
基因工程诞生的理论基础：
DNA是遗传物质的发现过程、DNA双螺旋结构的确立、遗传信息传递方式的认定。
2、基因工程的基本工具
（1）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） ① 来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
② 功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能切割（使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开），因此具有专一性。
黏性末端黏性末端
③ 结果：能将DNA分子切割成许多不同的片段。
备注：不同DNA分子用同一种限制性核酸内切酶切割形成的黏性末端都相同；同一个
DNA分子用不同限制性核酸内切酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
（2）“分子缝合针”——DNA连接酶
① 作用：将具有末端碱基互补的2个DNA片段连接在一起（缝合磷酸二酯键）形成的DNA分子称为重组DNA分子。 因此，DNA连接酶具有缝合DNA片段的作用，可以将外源基因和载体DNA连接在一起。
（3）“分子运输车”——载体——质粒 ① 载体具备的条件：
1）能在受体细胞中复制并稳定保存。 2）具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
3）具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
② 最常用的载体——质粒：
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质粒在细菌中以独立于拟核之外的方式存在，是一种特殊的遗传物质，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒。
③ 其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒
二、基因工程的原理和技术
2：目的基因的获得：
即获得我们所需要的基因，如人的胰岛素基因。 （1）目的基因：是指能编码蛋白质的结构基因。 （2）获得目的基因的两种方法：
①目的基因的序列已知：用化学方法合成目的基因或用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因
②目的基因的序列未知：建立一个包括目的基因在内的基因文库， 3、形成重组DNA分子：
就是将目的基因与载体DNA连接在一起。
通常是用相同的限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体DNA（如质粒），就会在目的基因和载体DNA的两端形成相同的黏性末端，然后用DNA连接酶将目的基因和载体DNA连接在一起，形成重组DNA分子。 4、将重组DNA分子导入受体细胞
用适当的方法将形成的重组DNA分子转移到合适的受体细胞中。
常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等。如用质粒作载体，宿主细胞应选择大肠杆菌，用氯化钙处理大肠杆菌，增加大肠杆菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入大肠杆菌宿主细胞。 5、筛选含有目的基因的受体细胞：
并不是所有细胞都接纳了重组DNA分子，因此需要筛选含有目的基因的受体细胞。 采用选择性培养基筛选。 6、目的基因的表达：
目的基因在宿主细胞中表达，能产生人们需要的功能物质。
第二章 克隆技术
一、什么是克隆
1、繁殖的方式：
（1）有性繁殖：经过异性生殖细胞的结合，产生合子，再由合子发育成下一代个体的繁殖方式。
（2）无性繁殖：不经过异性生殖细胞的结合，直接由母体产生下一代个体的繁殖方式。
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无限繁殖产生的个体保持了亲本的遗传性状，一次产生后代的数量可以很大，可以迅速扩大其种群的数量。 3、克隆技术：
是指才众多的基因或细胞群体中通过无性繁殖和选择获得目的基因或特定类型细胞的操作技术。
在分子水平上，基因克隆是指某种目的基因的复制、分离的过程；
在细胞水平上，细胞克隆技术在利用杂交瘤制备单克隆抗体的技术中得到应用； 在个体水平上，克隆技术就是一种通过单个细胞，特别是来自特定活体的单个体细胞进行无性繁殖从而产生新个体的过程或技术。
基因克隆和细胞克隆是现代生物技术中的关键技术。
从理论上说，由于细胞核具有基因组合全套遗传信息，生物的体细胞有潜力直接发育成胚胎和形成与核供体完全相同的个体克隆。
二、植物的克隆：
1、细胞全能性
（1）植物细胞全能性：指植物体的每个活细胞都具有遗传上的全能性，因而都具有发育成完整植株的潜能。
（2）植物细胞全能性的体现：
全能性表达的难易程度：受精卵＞生殖细胞＞干细胞＞体细胞；植物细胞＞动物细胞 ① 植物细胞全能性表达能力强：
实践表明，植物体的几乎所有组织（如根、茎、叶、花药、子房及幼胚等组织）的细胞，通过诱导都可再生新植株。即植物体的每个活细胞，即使是已经高度成熟和分化的细胞，都保持了恢复到分生状态的能力，都具有遗传上的全能性。所以植物的组织培养比动物更方便。
② 不同植物或同种植物不同基因型个体的细胞全能性有差异：
由于不同种类植物或同种植物的不同基因型个体之间遗传性的差异，细胞全能性的表达程度大不相同。如拟南芥、烟草和番茄等能在多个世代中保持细胞全能性的表达；而小麦、要么和水稻等在多次继代培养后会丧失细胞全能性的表达能力。
③ 长期培养中，细胞全能性表达能力下降的原因： 1）遗传物质不可逆改变：
染色体畸变、细胞核变异或非整倍体产生，且其结果不可逆； 2）生长发育条件变化：
细胞或组织中激素平衡被打破，或细胞对外源生长物质的敏感性发生改变； 3）由于其他原因产生了缺乏成胚性的细胞系。 ④植物克隆成功所需的条件：
1）深入探讨特定植物细胞全能性的表达条件（激素配比）；
2）在植物克隆实验中，选择性状优良、细胞全能性表达充分的基因型。 2.植物组织培养程序 （1） 概念：
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植物组织培养就是在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、生芽，最终形成完整的植株。
（2） 培养过程：
离体的植物器官、组织或细胞 ―→愈伤组织 ―→试管苗 ―→植物体
脱分化再分化离体的植物器官、组织、细胞????愈伤组织????根芽???植物体
愈伤组织：一种相对没有分化的活的薄壁细胞团组成的新生组织。（细胞排列疏松、无规则） 脱分化：已经高度分化的植物细胞，经过诱导重新恢复了分裂能力，产生愈伤组织的过程，又称去分化。
再分化：脱分化产生的愈伤组织经培养，重新分化根或芽等器官的过程。 组织培养具体过程：
① 配制含有适当营养物质和植物生长调节剂的半固体培养基（灭菌）； ② 从消毒的根、茎或叶上切取一些小组织块；
③ 将组织块放在培养基上培养，获得愈伤组织；（无需光）
植物组织切口处的细胞在创伤的刺激下发生脱分化称为分裂的细胞，不断进行分裂增殖，在创伤表面形成一种由相对没有分化的活的的薄壁细胞团组成的新生组织，即愈伤组织。
④ 以适当配比的营养物质和生长调节剂诱导愈伤组织，直到再生出新植株。（需要光）
（3）培养基的营养成分：
无机营养成分：水、矿质元素（全部），如硝酸盐、铵盐
有机营养成分：1） 碳源：蔗糖
2） 含N物质：氨基酸、维生素 3） 琼脂：0.7%—1%，起支持作用
植物生长调节剂：细胞分裂素、生长素 PH值：5.0－6.0
3、植物的克隆：
（1）理论基础：植物细胞的全能性 （2）技术基础：植物组织培养
（3）主要技术：植物细胞培养；植物器官培养；原生质体培养 4、植物细胞培养 （1）概念：
指以单个游离细胞为外植体的离体无菌培养。 其目的是通过大规模的细胞培养以获得人类所需的细胞次级代谢产物。 （2）采用技术：悬浮细胞培养：
通过液体悬浮培养使愈伤组织分散成单细胞，经适宜培养基中成分的诱导，可从单细胞依次到细胞团、球形胚、心形胚和胚状体，最后而形成新植株。 5、器官培养：
（1）概念：指以植物的根、茎、叶、花、果等器官为外植体的离体无菌培养。 （2）如何实现器官发生和形态建成：
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