实验六 酵母蔗糖酶的提取及纯化

实验六 酵母蔗糖酶的提取及纯化

原理

蔗糖酶（invertase）（?—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的?—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol蔗糖，就生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。

＋ H 2O

在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。

蔗糖酶

O H

H O

一、蔗糖酶的提取与部分纯化

（一）实验目的

学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。 （二）实验原理（略） （三）实验仪器、材料及试剂 仪器

1. 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱 2. 电子天平、研钵（＞200ml）、制冰机、50ml烧杯

3. 离心管（2ml，10ml，30ml或50ml）、移液器（1000ul）或滴管、量筒 材料及试剂

1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存）

2. 石英砂（海沙）、甲苯（使用前预冷到0℃以下）

3. 95%乙醇（预冷－20℃）、去离子水（使用前冷至4℃左右） 4. Tris-HCl（pH7.3）缓冲液 （四）操作步骤 1. 提取

（1）将市售鲜啤酒酵母2000 rpm，离心10 min，除去大量水分。 （2）将研钵稳妥放入冰浴中。

（3）称取50g鲜啤酒酵母，加30g石英砂放入研钵中，加50ml预冷的甲苯（边研边加）或预冷的去离子水，在研钵内研磨成糊状，然后每次缓慢加入预冷的10ml去离子水，边加边研磨以便将蔗糖酶充分转入水相。共加75ml去离子水，研磨约40~60分钟，使其成糊状液体。（注：研磨时可用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎）。

（4）将混合物转入50ml（或分装入2个30ml）离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机离心， 4℃，15000rpm，15min。观察结果：如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。 （4）用移液器（或滴管）吸出上层有机相（弃掉）。

（5）用移液器小心地取出脂肪层下面的水相液转入量筒，量出体积，并记录。

（6）取出2ml放入2ml离心管中（标记为粗级分I，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中。 2. 热处理

（1）将盛有粗级分I的小烧杯迅速地放入50℃恒温水浴中，保持30分钟，并用玻璃棒温和搅动。 （2）取出小烧杯，迅速用冰浴冷却，转入清洁的离心管中（根据量大小选择离心管），4℃，15000rpm，离心15min。

（3）将上清液转入量筒，量出体积，并记录。

（4）取出2ml放入2ml离心管中（标记为热级分II，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中。 3. 乙醇沉淀

（1）将盛有热处理后的上清液放入小烧杯，在冰浴下逐滴加入预冷的等体积（逐滴加入）95%乙醇，温和搅拌、放置，需1小时。

（2）转入清洁的离心管中，用4℃，15000rpm，离心15min，倾去上清，并滴干。

（3）离心管中沉淀用5~8mlTris-HCl（pH7.3）缓冲液充分溶解（若溶液混浊，则用离心管，4000rpm离心除去不溶物），转入量筒，量出体积，并记录。

（4）取出2ml放入2ml离心管中（标记为醇级分Ⅲ，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中，用于下一步实验。（注：离心管中沉淀也可盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存，用时再处理） （五）实验结果与分析

记录实验结果，并加以解释，若有异常现象出现，可进行分析讨论。

（六）注意事项

二、蔗糖酶活性及蛋白质浓度的测定

（一）实验目的

学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度，用Nelson方法测定酶活力。掌握各步骤的实验原理和方法。 （二）实验原理

本实验以Nelson方法测定酶活力，其原理是还原糖含有的自由醛基或酮基，在碱性溶液中将Cu2+还原成氧化亚铜，糖本身被氧化成羟酸，砷钼酸试剂与氧化亚铜生成蓝色溶液，在510nm下有正比于还原糖的吸收，从而可确定酶的活力，测定范围：25~200μg。

本实验用考马斯亮蓝结合法测定蛋白浓度，考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250－蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。在一定范围内，考马斯亮蓝G250－蛋白复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。 （三）实验仪器、材料及试剂 仪器

1. 722型（或7220型）分光光度计、电子分析天平、恒温水浴箱 2. 量筒、容量瓶、移液器、试管。 材料及试剂

1. 考马斯亮蓝(G250)染液（0.01%）：称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml 95%乙醇中，再加入100ml浓磷酸（市售质量百分渡为85%），然后加蒸馏水定容至1000ml。 2. 0.9% NaCl溶液

3. 牛血清标准蛋白液（0.1mg/ml）：准确称取牛血清蛋白0.1g，用0.9% NaCl溶液溶解并稀释至1000ml。

4. 4mmol/L葡萄糖、4mmol/L蔗糖、0.5mmol/L蔗糖。 5. 0.2mol/L乙酸缓冲溶液(pH4.5)：

（1）0.2mol/L NaAC：称取27.616g NaAC溶解并定容至1000ml。 （2）0.2mol/L HAC：100ml乙酸(分析纯)定容至500ml。 （3）将两者分别取315ml、185ml混合，用强碱调pH到4.5。 6. Nelson试剂：

A试剂：100ml溶剂中含 Na2CO3 2.5g， NaHCO3 2.0g ， 酒石酸钾钠（酒石酸钠）2.5g， Na2SO4 20g。

B试剂：100ml溶剂中含 CuSO4?5H2O 15g，浓H2SO4 2滴。

以A：B=50：2比例混合即可使用，使用前需在37℃以上溶解，防止溶质析出。

7. 砷钼酸试剂：100ml中含钼酸铵 5g ，浓H2SO4 4.2ml，砷酸钠 0.6g。（砷酸钠有毒，实验中注意） （四）操作步骤

1．各级分蛋白质浓度测定

（1）蛋白质浓度测定――标准曲线的制备

取7支干净试管，按表1编号并加入试剂混匀。以吸光度平均值为纵坐标，各管蛋白含量作为横坐标作图得标准曲线。（或将数据代入线性回归方程，求出Y？和r？）

表1 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度――标准曲线的绘制 编 号 标准蛋白液/ml 0.9%NaCl/ml 考马斯亮蓝/ml 蛋白含量/μg 0 — 1.0 4 0 1 0.1 0.9 4 10 2 0.2 0.8 4 20 3 0.3 0.7 4 30 4 0.4 0.6 4 40 5 0.5 0.5 4 50 6 0.6 0.4 4 60 室温静置5min A595nm

（2）各级分蛋白浓度的测定

取9支干净试管，每级分做两管，按表2编号并加入试剂混匀。读取吸光度值。以各级分的吸光度的平均值查标准曲线即可求出蛋白质含量。各级分应进行一定倍数的稀释，先试做，选其吸光度值在标准曲线内，即蛋白含量应在10~80μg 的稀释度为宜。

表2 各级分蛋白浓度的测定 编 号 粗级分I/ ml 热级分II/ ml 醇级分III/ ml 4 1 4 4 2 4 4 3 4 4 4 4 柱级分IV/ ml 0.9%NaCl/ml 考马斯亮蓝/ml 各级分应进行一定倍数的稀释，先试做，选其吸光度值在标准曲线内，即蛋蛋白含量/μg A595nm A595nm 平均值 各级分蛋白浓度mg/ml 白含量应在10~80μg 的稀释度为宜 室温静置5min

2．各级分蔗糖酶活性的测定

（1）蔗糖酶活性的测定――标准曲线的制作

取9支试管，按表3加样。以吸光度值（O.D）为纵坐标，以还原糖（葡萄糖含量，μmol）作为横坐标作图得标准曲线。（或将数据代入线性回归方程，求出Y？和r？） （2）各级分蔗糖酶活性测定

取9支干净试管，分两组，按表4编号并加入试剂混匀。各级分酶液应进行一定倍数的稀释，先试做，选其吸光度值在标准曲线内，即还原糖含量应在0.08~1.2μmol的稀释度为宜。读取吸光度值。以各级分的吸光度的平均值查标准曲线即可求出蛋白质含量。

表3 Nelson法测定蔗糖酶活性――标准曲线的绘制

编号 4mmol/L葡萄糖/ml 4mmol/L蔗糖/ml 蒸馏水/ml 葡萄糖量/μmol 0 － － 1 0 1 0.02 － 0.98 0.08 2 0.05 － 0.95 0.2 3 0.10 － 0.90 0.4 4 0.15 － 0.85 0.6 2+5 0.20 － 0.80 0.8 6 0.25 － 0.75 1 7 0.30 － 0.70 1.2 8 — 0.2 0.80 向每管中加入1ml Nelson试剂，盖上塞子，置于沸水浴中20分钟，再冷至室温 Nelson试剂 砷钼酸试剂 蒸馏水/ml A510nm （在碱性条件下糖被氧化，将Cu还原成氧化亚铜（Cu20） 向每个管中加入1ml砷钼酸试剂，5分钟 （砷钼酸试剂与氧化亚铜生成蓝色溶液） 向每个管中加入7ml蒸馏水，充分混匀

表4 各级分蔗糖酶活性测定

样品 编号 乙酸缓冲液/ml 蒸馏水/ml 0.5mol/L蔗糖/ml 各级分酶液/ml 室温时间/min Nelson试剂 砷钼酸试剂 蒸馏水/ml 1 A510nm 2 A510n A510nm平均值 0 0 0 空白 0 0.2 0.6 0.2 — 粗级分I 1 0.2 0.2 ？ 2 0.2 0.2 ？ 热级分II 1 0.2 0.2 ？ 2 0.2 0.2 ？ 10分钟 向每管中加入1ml Nelson试剂，盖上塞子，置于沸水浴中20分钟后冷至室温 向每个管中加入1ml砷钼酸试剂，5分钟 向每个管中加入7ml蒸馏水，充分混匀 醇级分III 1 0.2 0.2 ？ 2 0.2 0.2 ？ 柱级分IV 1 0.2 0.2 ？ 2 0.2 0.2 ？

（3）活力和比活力的计算

活力单位（U）：酶在室温，pH=4.5条件下，每分钟水解产生1μmol葡萄糖所需酶量。 根据测得结果，计算出各步数据填入下表 各级分样液 体积/ml 粗级分I 热级分II 醇级分III 柱级分IV 蛋白mg/ml 总蛋白mg 活力U 总活力U 比活力U/mg 提纯倍数 回收率

（五）实验结果与分析

记录实验结果，并加以解释，若有异常现象出现，可进行分析讨论。

（六）注意事项