酵母高通量筛选耐干旱基因报告 

实 验 报 告

酵母筛选耐干旱基因

酵母高通量筛选耐干旱基因结题报告

目的：

筛选某物种文库在酵母菌株BY4741中耐干旱的基因。 方法：

将pYES2空载转化酵母菌株BY4741作为对照组，通过酵母表型验证，筛选耐干旱基因。 材料：

1．载体：pYES2 2．培养基：

1). 酵母完全培养基：

YPDA：1% Yeast extract，2% Tryptone，2% Glucose，0.02% Adenine。 2). 酵母缺陷型筛选培养基：

参照Clontech公司的PT3024-1/Yeast Protocols Handbook，其中各种培养基分别以下列符号表示：SD-U：-Ura，SG-U：-Ura。 3. 其他贮备液：

10 × TE：0.1 M Tris-HCl（pH7.5），10 mM EDTA，高压灭菌； 10 × LiAc：1 M LiAc (pH7.5)，高压灭菌。

第一部分 文库构建

之前已完成某物种文库构建。 第二部分 将空载质粒转化受体菌BY4741 1.1酵母转化

将以下质粒分别转入BY4741中：

Reaction

1

1.2 酵母转化方法

1. 从YPDA平板挑取BY4741单菌落接种于YPDA液体培养基4 ml，30℃，225 rpm，振荡培养18-20 h（过夜），至OD600>1.5。

2. 转接YPDA液体培养基，培养体积为50 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5h，至OD600=0.6。 3. 离心收菌，室温，4000 rpm，5 min。

4. 用20 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。

5. 用5 ml 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。

6. 用500 ul 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5 ml离心管，每个50 ul（每个转化），备用。

7. 每个1.5 ml离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。

50%PEG3350

1 M LiAc

ssDNA (20 mg/ml) 质粒DNA

plasmid pYES2

涂板种类 SD-U

备注 对照组

240 ul

8. 30℃水浴孵育，30 min。 9. 42℃水浴热激，25 min。 10. 30℃水浴复苏，30 min。

36 ul 5 ul 5 ul

11. 离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。

12. 每个转化用200 ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板。

13. 30℃恒温培养4天。 1.3 阳性克隆 PCR验证

从转化的平板上随机挑取8个点，进行PCR验证，验证正确的菌保留。

第三部分 将某物种文库转化受体菌BY4741 1.1 文库质粒转化

1. 从YPD平板挑取单菌种接于液体YPD培养基5 ml，30℃，225 rpm，振荡培养24 h。

2. 转接于YPDA液体50 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5 h，至OD600=0.6。

3. 离心收菌，室温，4000 rpm，5 min。

4. 用30 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。

5. 用20 ml 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。

6. 用10 ml 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm ，5 min，弃上清。

7. 向离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。

50%PEG3350

9.6 ml

1 M LiAc 1.44 ml

ssDNA (10 mg/ml)

300 ul

文库质粒DNA

25 ug

8. 30℃水浴孵育，30 min。 9. 42℃水浴热激，25 min。 10. 30℃水浴复苏1 h。

11. 离心收菌，室温，4000 rpm ，5 min，弃上清，用6 ml无菌水重悬菌体，尽量温和地混匀，从中取20 ul培养物稀释后涂SG-U平板，共20块。 12. 30℃恒温培养3-7天，观察菌落生长。

13. 待菌落长出，用YPD液体培养基把板上菌落刮下，以500 ul/管分装，加入500 ul 50%甘油制备成酵母工作菌液，保存于-80℃。

14. 从中取10 ul稀释105倍，涂布于SG-U平板，用于检测文库库容，30℃恒温培养3-7天，观察菌落生长并计数。

15. 随机取24个克隆进行菌落PCR验证文库转化质量。

第四部分 甘露醇浓度筛选

1. 挑取上述菌p验证正确的克隆在含有2%葡萄糖的液体培养基SG-U摇菌至

OD600在1.2-1.4之间。 2. 4000 rpm，5 min离心去上清。

3. 用不含碳源的液体培养基SG-U清洗上述收集的酵母细胞并振荡培养3 h。 4. 4000 rpm，5 min离心去上清。

5. 用2%半乳糖的SG-U继续震荡培养8-12 h，调整OD600=1.0后按1:1，

1:10，1:100，1:1000，1：10000梯度分别点板在含0 mM ，100 mM，200 mM，500 mM，1 M甘露醇的固体培养基SG-U上，30℃恒温培养7天后，观察菌落生长情况，确定甘露醇浓度筛选条件。 6. 在上述条件下，涂布文库工作菌液，共20个平板。 7. 待克隆长出后，随机挑取96个克隆进行菌落PCR并测序。 8. 测序结果BLAST比对后，进行回转验证。

第五部分 实验结果 5.1 甘露醇浓度筛选

图1. 条件筛选结果

结论：对照组在含100mM甘露醇的浓度下1:10000无生长，而实验组在1:10000依然生长。

5.2 测序结果BLAST

为了鉴定筛选到的阳性克隆分别是什么基因，需要从酵母细胞中扩增出这些阳性克隆进行DNA测序，并与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对分析。 注：扩增阳性克隆使用的是南京瑞源生物技术有限公司自主研发的一款快速扩增酵母阳性克隆试剂盒(Yeast Colony Rapid Detection Kit，货号：RY8001)。 96个阳性酵母克隆，全部PCR扩增，经过Seqman、BLAST比对，去除空载和重复序列最终获得33个不同的序列。 结果见附件表格 5.3 回转验证 SG-U：

SG-U+100 mM甘露醇（1：10000）：

图2. 回转验证结果

回转验证结果表明：

阴性对照能在SG-U上生长，在SG-U+100 mM甘露醇（1：10000）上不能生长。

筛选到的33个克隆均能在SG-U、SG-U+100 mM甘露醇（1：10000）平板上生长。