第十三章 生物实验的基本技术
第一节 细胞学实验技术
【知识概要】
一、玻片标本的制作技术
制作玻片标本对认识生物体的形态结构具有重要意义。玻片标本有临时玻片标本（如涂片、压片、临时装片）和永久玻片标本（如永久装片、切片）。
1．涂片法
涂片法是将材料均匀地涂布在载玻片上的一种制片方法。
涂片材料有单细胞生物、小型藻类、血液、细菌培养液、动植物的疏松组织、精巢、花药等。
涂片时应注意：（1）载玻片必须清洁。（2）载玻片要持平。（3）涂层须均匀。涂抹液滴在载玻片中间偏右，用解剖刀刃或牙签等涂匀。（4）涂层要薄。用另一载玻片作推片，沿滴有涂抹液的载玻片面（二载玻片夹角应为30°～45°）由右向左轻轻推动，涂成均匀一薄层。（5）固定。如需固定可用化学固定剂或干燥法（细菌）固定。（6）染色。细菌用亚甲基蓝，血液用瑞氏染液。染色液要盖住全部涂面。（7）冲洗。用吸水纸吸干或烤干。（8）封片。长期保存用加拿大的树胶片片。
2．压片法
压片法是将生物材料置于载玻片和盖片之间，施加一定压力，将组织细胞压散的一种制片方法。
压片法的一般过程：（1）取材。观察细胞分裂，应选取细胞分裂旺盛、新鲜的组织细胞为材料。如根尖、茎尖分生组织、骨髓细胞、花药（花粉母细胞）。精巢（精母细胞）等。（2）固定。材料固定可根据需要而定，取材后立即压片观察，可不作单独固定处理（与染色同步进行）；取材后不立即视察，可将材料用固定液（一般用醋酸酒精固定液）固定。固定2～24小时（因材料而异）后用95％乙醇清洗，保存于70％乙醇中，备用。（3）离析。对细胞不易散开材料用水解分离液（如1N HCl或盐酸一酒精液）处理，一般处理6～20min，解离后经水漂洗后方能染色。（4）染色。染色剂种类很多。观察染色体常用醋酸洋红染色液染色。（5）压片。将材料放在载玻片上，加一滴清水或染液，盖上盖玻片用拇指轻轻压片。（6）观察。压片后，即可在显微镜下观察。
3．装片法 装片法是将生物材料采取整体封固制成玻片标本的方法，用此法可制成临时或永久装片。
装片材料有：微小生物如衣藻、水绵、变形虫、水螅，植物的叶表皮；昆虫的翅、足、口器，人的口腔上皮细胞等。
装片法制作时应注意：（1）手持载玻片时，应注意持平，或放在平台上。滴水时水量要适当，以恰好被盖玻片盖满为度。（2）应将材料用解剖针或镊子展开不使重叠，展平在同一平面上。（3）放盖玻片时，从一侧慢慢盖在水滴上，防止出现气泡。（4）染色时，将一滴染色液滴在盖玻片的一侧，用吸水纸从另一侧吸引，使盖玻片下的标本均匀
1
着色。着色后，用同样的方法，滴一滴清水，把染色液吸出后，在显微镜下观察。
二、显微镜基本实验技术
1．低倍镜（4X、10X）的使用方法
显微镜操作主要包括两个方面：（1）光度调节。正确对光是能否成功地观察到物象的首要条件。对光时，先把聚光器上提，打开可变阑，转动反光镜，这时一边看镜内视野，一边调节聚光器螺旋，直至视野内得到均匀而明亮的光线。（2）焦距的调节。调焦时，先把观察的切片，用推进器对正通光孔中央。然后分两步调焦。先用粗调器定焦，用左眼看目镜，使粗调器慢慢上升，直到能清楚地看到标本为止。随后调节细调器，使镜筒微微升降，至物象更清晰为止。
2．高倍镜（40X）的使用方法
（1）将在低倍镜中找到的物象欲放大部分移到视野中央。（2）转动物镜转换器，使40X物镜对准通光孔，转动时从侧面注视物镜，以防镜头紧压玻片。（3）调节细调螺旋，使物象清晰。
3．油镜（100X）的使用方法
（l）先用低倍镜找到欲观察细微结构，将其结构移至视野中央换高倍镜。（2）下降镜台，在玻片标本上滴一滴香柏油，转换油镜。从侧面注视油镜，把镜台上升，使油镜头浸在香柏油滴中。（3）转动细调螺旋，使物象清晰，进行观察。（4）观察完毕，用镜头纸擦去油镜头和玻片上的香柏油，再用少许二甲苯或乙醚 / 无水乙醇把镜头擦干净。
4．安装指针的简易方法
将目镜的上盖（一片透镜）旋下，剪取一小段头发（其长度约等于目镜的半径），用镊子夹住一端，将另一端蘸少许中性胶，将其粘在目镜内壁的金属光栏（一铁圈）上。稍干后，旋紧上盖，即可使用。
三、单细胞的计数方法
在细菌培养和体外细胞培养，以及环境监测血液检查中常常需要统计细菌、细胞、单细胞藻类、原生动物、血细胞、花粉等数量。细胞计数方法的原理是把一定体积的细胞液体，在显微镜下直接计算其个数，利用所得结果推算出每毫升水体中的单细胞数。具体方法如下：
1．水滴计数法
用管口圆而平滑、大小适宜的吸管，吸取1mL水，然后测定这一吸管1rnL水可滴出多少滴水（反复测定，直到准确为止）。这样可以计算出该吸管滴出的每一滴水的体积。用吸管取样时，如果单细胞是活动的要用碘杀死后，再计数；如果样品浓度太大，计数困难，按倍数稀释到适宜的浓度；另外，取样前必须搅拌，搅拌后，立即取样。取样后，在显微镜下计数，得到一滴水中细胞数的平均值后，可依下列公式求出1mL水体中所含细胞的数目。
1mL水体中含细胞数＝计数平均值×定量吸管每毫升的滴数×稀释倍数
2．血球计数板计数法
血球计数板是由一块厚玻片特制而成，其中央有两个计数室。每个计数室划分出9个大方格（见下图），每格面积1mm，加盖玻片后的深度为0.1mm。因此，每大方格容积为0.1mm。另外，中央大方格以双线等分为25个中方格。每个中方格又分16个小方
2
2
格，供细胞计数用。
1 2
3 4
血球计数板的构造
l．顶面观 2．侧面观 3．放大后的网格 4．放大后的计数室
计数方法：首先用吸管吸取少许稀释倍数的单细胞悬液，从盖片端滴一小滴（不宜过多），液体自行向内渗入，静置数分钟后，再放在微镜下观察计数。一般选取计数室内四个角及中央五个中方格（80小方格）计数，若细胞位于小方格的线上，应遵循“数上线不数下线，数左线不数右线”的原则，以减少误差。计数应重复3次，取其平均值。数完毕后，依下式计算：
每1mL悬液细胞数或每克细胞数＝80个小方格细胞总数 / 80×400×10000×稀释倍数
四、显微测微尺的应用方法
显微测微尺是在显微镜下测量生物细微结构的测微工具，用它测量细胞各部分的厚薄和大小。
显微测微尺（见下图）包括目镜测微尺（目尺）和物镜测微尺（台尺），测量时须将其配合使用方可达到测量目的。目镜测微尺为一圆形玻片，玻片中央有一横线刻有大小格的等距离线。物镜测微尺有一特制的玻片，中央圆圈内有一1mm长分为100个等距小格的刻线，每一小格即10μm。
3
目镜测微尺 物镜测微尺
显微测微尺
测量方法：首先须算出目镜测微尺的每一格在不同倍物镜下各为多少μm。即取下接目镜卸下透镜，装上目镜测微尺。然后将物镜测微尺放在镜台中央，眼观目镜，调好焦距，使两种测微尺上的刻度平行并重叠在一起。按下面公式计算出目镜测微尺每格的实际长度。
目镜测微尺每格的长度（μm）＝物镜测微尺的格数 / 目镜测微尺的格数×10 计算出目镜测微尺每格的实际长度后，再在镜台上放上需要测量的物体标本或玻片标本，即可用目镜测微尺测出它们的长度。 五、显微结构图的绘制技巧
生物绘图是科学记录的一种方法。绘图时应注意：（1）绘科学图以精确为主，不能艺术加工渲染。（2）只在纸的一面绘图。绘图时要用2H以上绘图铅笔，纸面力求整洁。（3）绘图大小适宜，布局合理。一般要求图画在纸的稍偏左侧，留出图注的位置。（4）图的各部分的位置和比例，应与显微镜中实际观察的一致，而要注意突出显微结构的每个特征。（5）显微构造图的点线不要重复描绘。以实线表示轮廓，虚线表示被遮蔽但需表现的轮廓，用圆点的疏密来表示明暗、凹凸等层次。点点时笔尖直立。点的大小、疏密要均匀、整齐、浑圆。（6）绘图时，一般先草拟轮廓图，经检查无误后，再以准确、清晰的线作最后的描绘。
【解题指导】 例1 用显微镜观察洋葱根尖细胞的有丝分裂，要看清各时期细胞内染色体的变化情况，目镜、物镜的合理搭配应该是
A 目镜（24X）、物镜（10X，N·A0.25） B 目镜（ 5X）、物镜（40X，N·A0.65） C 目镜（10X）、物镜（40X，N·A0.65）
D 目镜（24X）、物镜（40X，N·A0.65）
析 此题属镜像亮度问题。镜像亮度与物镜镜口率（N·A）平方成正比，与总放大倍数成反比。由此，在总放大倍数相同情况下，要使物像亮度增加，应该使用高镜口率（N·A）的物镜与低倍目镜配合，根据这一原理应选择C。
例2 在观察显微镜时，经常遇到以下5种现象：（1）视野亮度晃眼；（2）视野不圆；（3）对光时视野中出现窗棂、树影等物现象；（4）只见视野不见图像；（5）图像结构不完整，试分析出现这些现象的可能原因，并提出排除方法。
析 （1）视野亮度晃眼，可能原因：①反光镜直射强光源；②光照到通光孔上缘。
4
相关推荐：
loading