否已被分解而呈透明。
酪氨酸水解实验
将营养琼脂融化,冷却至温热,与L-酪氨酸混匀,分别将菌种点接在平板上,37℃培养24h。记录菌落周围是否有透明圈,若有,则菌株能够水解酪氨酸。
卵黄反应试验
步骤:取18-24h的斜面或培养液中的菌体点种在上述平板上,点的直径约为2-3mm。每个平板可分散点5-7株菌,以不影响观察为宜,适温培养18-24h观察。如菌落四周和下面有不透明的区出现,表示卵磷脂分解生成脂肪,说明有卵磷脂酶。
淀粉水解试验
用18-24h的纯培养物,涂布接种于淀粉琼脂平板(一个平板可分区划“+“字接种,),于37℃培养24-48h。然后将碘试剂完全浸于培养表面。立即检视结果,阳性反应(淀粉被分解)为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或菌苔周围出现无色透明环。阴性反应则无透明环。
0.001%溶菌酶试验
将菌种制成菌悬液,用无菌玻璃涂棒涂布在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上,然后用在溶菌酶试剂中浸湿的滤纸片贴在平板上,培养24h后观察有无抑菌圈的出现,若有为阳性反应,否则为阴性反应。
2.4菌种鉴定
根据从伯杰式细菌学手册芽孢杆菌属中检索到的芽孢杆菌的生理生化特点,选取能从土壤中分离到的芽孢杆菌种为标准菌种,其生理生化指标如下表:
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通过对目的菌种进行多项生理生化实验,对比伯杰式手册的实验结果,从而鉴定出目的菌的种别;
四、实验结果分析
1、分离纯化 1.1菌株的初筛
1.1.1通过80℃水浴20min分别对AB土样进行预处理,杀死无芽孢菌体。
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1.1.2把处理过的菌悬液离心取上清液,稀释到不同梯度,每个梯度分别涂布到营养琼脂培养基,27℃保温箱培养24h,获得长有不同菌落的培养基。用接种环挑取8个菌落形态不同的单菌落于筛选培养基中进行分区划线,划线结束后,置于在37 ℃下恒温培养12~24h,每过12~24h重复此操作共3次。分别通过3次分区划线,分离纯化初筛所得到的8株菌,把这些菌进行编为1~8号。 1.1.3把这8株菌接种到淀粉培养基中,筛选出能产淀粉酶的菌株,结果只有1、2、3、4号株菌有透明圈;5号菌有一个平板没有接种到,为了实验准确性,放弃5号;6、7、8号菌均未产生透明圈,即不产淀粉酶,不符合目标菌株要求,放弃。 1.2菌株的复筛 1.2.1单染色
经单染色镜鉴,2号菌株不是纯培养,有杂菌,不符要求;1、3、4菌株鉴定为纯培养,符合要求。
(3号菌株单染色)
1.2.2芽孢染色
经芽孢染色镜鉴,观察到1、4号菌株无芽孢,3号菌株有芽孢,芽孢中生,菌株比较年轻,是芽孢杆菌。
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(3号菌株芽孢染色)
1.2.3革兰氏染色
对3号菌株进行革兰氏染色,被染成红色,是革兰氏阴性菌。 最终得到能产淀粉酶的芽孢杆菌,把菌株接种到斜面培养,保存菌株。 2初步鉴定 2.1形态学鉴定
3号菌的形态特征:乳白色,湿润,不透明,菌落较厚,整体突起,表面粗糙,菌落边缘不整齐凹凸不平,菌落较粘稠,像鼻涕一样不容易被挑起。 2.2生理生化鉴定 温度对微生物生长的影响
5℃、50℃、55℃、60℃、65℃不长菌,15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃长菌,且20-40长势较好。3号菌比较适宜的生长温度大概是20-45℃的范围。
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