微生物限度检查SOP

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色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽 麦康凯琼脂 鲜桃红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润 8.2.4.大肠菌群（Coliform）检查 取含适量（不少于10-ml）的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别加入1：10的供试液1ml（含供试品0.1g或0.1ml），1：100的供试液1ml（含供试品0.01g或0.01ml），1：1000的供试液1ml（含供试品0.001g或0.001ml），另取1支胆盐乳糖发酵培养基管加入稀释液1ml作为阴性对照管，培养18～24小时。

胆酸乳糖发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠菌群；若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。

若平板上无菌落生长，或生长的菌落与表2所列的菌落形态特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；若平板上生产的菌落与表2所列的菌落形态特征相符合或疑 似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。 表2 大肠菌群菌落形态特征 培养基 曙红亚甲蓝琼脂 菌落形态 呈紫黑色、紫红色、红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边 缘整齐，表面光滑，湿润 麦康凯琼脂 鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润 确证试验 从上述分离平板上挑选4～5个疑似菌落，分别接种与乳糖发酵管中，培养24～48小时，若产酸产气，判该胆盐乳糖发酵管检出大肠菌群，否则判未检出大肠菌群。 根据大肠菌群的检出管数，按表3报告1g或1ml供试品中的大肠菌群数。 表3 可能的大肠菌群数表 各供试品量的检出结果 0.1g或0.1ml + + + － 0.01g或0.001ml + + － － 0.001g或0.001ml + － － － 可能的大肠菌群数N（个/g或ml） ＞103 102＜N＜103 10＜N＜102 ＜10 第 10 页 共 21 页

注：+代表检出菌群；－代表未检出大肠菌群

8.2.4.沙门菌（Salmonella） 检查 取供试品10g或10ml，直接或处理后接种至适量（不少于200ml）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，培养18～24小时。 取上述培养物1ml，接种于10ml四硫磺钠亮绿培养基中，培养18～24小时（必要时延长至40～48小时）。若平板上无菌生长，或生长的菌落不同于表4所列的特征，判供试品未检出沙门菌。

若平板上生长的菌落数与表4所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选2～3个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面和高层穿刺接种，培养18～24小时，如斜面未见红色、底层无黑色，判供试品未检出沙门菌，否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的生化试验或血清凝集试验，确认是否为沙门菌。

表4 沙门菌菌落形态特征 培养基 胆酸硫乳琼脂 菌落形态 无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色 沙门、志贺菌属琼脂 无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色 曙红亚甲蓝琼脂 麦康凯琼脂 无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落 无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色 8.2.5.铜绿假单细胞（Pseudomonas aeruginosa） 检查 取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2）,直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时。取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。

铜绿假单细胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。如平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出铜绿假单胞菌。如平板生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2～3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～24小时。取斜面培养物进行革兰染色、镜检及氧化酶试验。

氧化酶试验 取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取斜面培养物涂于纸片上，滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30秒内若培养物呈粉红色并逐见变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。

若斜面培养物为革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则，应 进行绿脓菌素试验。

绿脓菌素（Pyocyanin）试验 取斜面培养物接种于PDP琼脂培养斜面上，培养24小时，加

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三氯甲烷3～5ml至培养管中，搅碎培养基并充分振摇，静置片刻，将三氯甲烷相移至另一试管中，加入1mol/L盐酸试液1ml，振摇后，静置片刻，观察。若盐酸溶液显粉红色，为绿脓菌素试验阳性，否则为阴性，同时用未接种的PDP琼脂培养基斜面同法作阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。

若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，判供试品检出铜绿甲单细胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性，应继续进行适宜的生化试验，确认是否为铜绿假单胞菌。

8.2.5.金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）检查 取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2）。直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的亚碲酸钠（钾）肉汤（或营养肉汤）培养基中，培养18～24小时，必要时可延长至48小时。取上述培养物，划线借种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养24～72小时。若平板上无菌落生

长或生长的菌落不同于表5所列特征，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。 表5 金黄色葡萄球菌菌落形态特征 培养基 甘露醇氯化钠琼脂 卵黄氯化钠琼脂 菌落形态 金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环，菌落直径0.7～1㎜ 金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径1～2㎜ 若平板上生长的菌落与表5所列的菌落特征相符或疑似，应挑选2～3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～24小时。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰染色，并接种于营养肉汤培养基中，培养18～24小时，作血浆凝固酶试验。

血浆凝固酶试验 取灭菌小试管3支，各加入血浆和无菌水混合液（1：1）0.5ml，再分别加入可疑菌株的营养肉汤培养基（或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液）0.5ml、金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物（或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液）0.5ml，即为试验管、阳性对照管和阴性对照管。将3管同时培养，3小时后开始观察直至24小时。阴性对照管的血浆应流动自如，阴性对照管血浆应凝固，若试验管血浆凝固者为血浆凝固酶试验阳性，否则为阴性。如阳性对照管或阴性对照管不符合规定时，应另制备血浆，重新试验。

若上述疑似菌为非革兰阳性球菌、血浆凝固酶试验阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。 8.2.6梭菌（clostrdium）检查 取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml）2份，其中1份置80℃保温10分钟后迅速冷却。上述2份供试液直接或处理后分别接种至100ml的0.1%新鲜

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庖肉培养基中。各培养基管在厌氧条件下培养72～96小时。如试验管不出现浑浊、产气、消化碎肉、臭气等现象，判供试品未检出梭菌；否则，应取上述培养物0.2ml，涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，在厌氧条件下培养48～72小时。若平板上无菌落生长，判供试品未检出梭菌；若平板上有菌落生长，应挑选2～3个菌落分别进行革兰染色和过氧化氢酶试验。

过氧化氢酶试验 取上述平板上的菌落，置洁净玻片上，滴加3%过氧化氢试液，若菌落表面有气泡产生，为过氧化氢酶试验阳性，否则为阴性。

若上述可疑菌落为革兰阳性梭菌，有或无卵圆形或球形的芽孢，过氧化氢酶阴性，判供试品检出梭菌，否则判供试品未检出梭菌。 9.微生物限度检查结果判断

9.1.供试品检出控制或其他治病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。

9.2.供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以3次结果的平均值报告菌数。

9.3.眼用制剂检出霉菌和酵母菌数时，须以两次复试结果均不得长菌，方可判供试品的霉菌和酵母菌数符合该品种项下的规定。

9.4.若供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数、控制菌三项检验结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定。判供试品不符合规定。 10.稀释液

稀释液配制后，应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

10.1.PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 取磷酸二氢钾3.56 g，磷酸氢二钠7.23 g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。

10.2.PH6.8无菌磷酸盐缓冲液、Ph7.6无菌磷酸盐缓冲液按缓冲液（附录XV D）配制后，过滤，分装，灭菌。

如需要，可在上述稀释液灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。

9.5.3. 0.9%无菌氯化钠溶液 取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。 11.培养基及其制备方法

培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合要求的脱水培养基。配制后，应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

11.1.营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基及改良马丁琼脂培养基照无菌检查法（附录XIII B）制备。 11.2.玫瑰红钠琼脂培养基