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毕业论文引言

1 引言

核苷酸及其衍生物在食品、医学、农业、化妆品、及生化试剂等领域具有十分广泛的用途。尤其在我国核苷酸的需求量很大，但主要依靠进口，在这个方面缺口很大[1]。目前核苷酸的生产工艺不完善，利用酶解法生产核苷酸以及酶解工艺条件的研究，在国内报道的很少，国内吴莉莉等人曾利用双酶法降解核酸，生产呈味核苷酸i+g[2]。杨斌等人也对利用酶解法生产呈味核苷酸的生产进行过论述，但是都未曾对酶解核酸的工艺条件进行过优化摸索工作。 目前，对于核苷酸三种主要生产方法相比较而言，酶解法成本低，同时可以生产四种产品，明显优于其他两种生产方法。对于酶解法利用的原料rna，可以从啤酒废酵母中提取，解决了啤酒厂废酵母的出路，做到了资源的再生和利用。再对提取rna的废酵母考虑综合利用，可以产生更大的经济效益和社会效益。虽然酶解法生产四种核苷酸有很大的优越性，但是，该方法中存在着以下几个主要问题:1、原料质量差。目前国内rna的纯度在80%左右，溶解后存在大量的杂蛋白，降低了酶解率。并且由于杂蛋白的存在增加了分离的难度。2、生产的菌株水平低：利用桔青霉作为生产核酸酶p1的菌株，其生产的酶活仅为国外菌株的60%，对rna的酶解率仅为70-85%，国外酶解率可以达到85%-95%。3、离交分离收率低：一方面由于酶解不彻底，存在许多杂质如寡聚核苷酸等，增加了分离难度；另一方面由于分离材料的选择性差，对5’-核苷酸的吸附容量小，不能高效的分离四种核苷酸。4、结晶技术不过关。 所以通过rna水解实验的研究，对rna水解条件进一步优化，得出水解rna的最佳工艺，尽可能多的得到单核苷酸，应用在各个领域。 1.1 核糖核酸酶 1.1.1 概述

从20世纪60年代以来，核糖核酸酶作为一种模型蛋白被普遍用于分子生物学研究。核糖核酸酶（rnase）的全名为聚核苷-α-寡核苷酸转移酶，是一类广泛存在于动植物体内的水解核酸链中磷酸二酯键的酶。这些酶对核酸的作用是水解核苷酸残基之间的磷酸二酯键，生成寡聚核苷酸或单核苷酸。rnase的主要生理功能是控制细胞内rna的种类与数量分布，除参与核糖核酸转录后的

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剪切、修饰和降解等过程外，还与某些植物的自交不亲和性、器官发生、宿主的防御机制、控制肿瘤血管生成、杀灭肿瘤细胞及抑制病毒复制等有关[3]。 1.1.2 核糖核酸酶的分类

根据酶作用核酸分子部位的不同，可分为3’-磷酸二酯酶和5’-磷酸二酯酶。根据反应的最适ph不同分为酸性核糖核酸酶和碱性核糖核酸酶。酸性核糖核酸酶主要存在于细胞的溶酶体中，水解所吞噬的异物中的rna；碱性核糖核酸酶存在于胞液中，水解胞液中的rna。根据降解rna底物的不同一般分为3类：rnaseⅰ既能催化rna 水解，又可催化dna水解，产生5’-单核低聚核糖核苷酸或5’-单核低聚脱氧核糖核苷酸；rnaseⅱ仅使rna释放2’、3’环状嘌呤核糖核苷酸和3’-嘌呤核糖核苷酸；rnaseⅲ只水解rna释放2’、3’环状嘌呤或嘧啶核糖核苷酸和3’-嘌呤或嘧啶核糖核苷酸。根据酶作用的专一性[2]可分为核酸外切酶①蛇毒磷酸二酯酶：从毒蛇的毒液中提取的，它从核酸的单链的3’-oh端开始水解，生成5’-单核苷酸，该酶的最适ph为9，ca2+和mg2+为激活剂，还原剂和螯合剂抑制酶活力；②脾磷酸二酯酶：从牛脾中提取的，水解产物为3’-单核苷酸。核酸内切酶：核酸酶s1从米曲霉菌中提取出来的单链专一性内切酶，产生5’-单核苷酸，最适ph为4.5-5.0，需要

zn2+、co2+也可刺激酶活力，但mg2+、ca2+、cu2+无效。该酶对热较稳定，底物存在时于65℃保温不失活。内切兼外切酶：核酸酶p1从桔青霉制得的，故又称桔青5’-磷酸二酯酶，纯化的p1酶对单链专一；最适温度70℃，最适ph5；zn2+为激活剂。8mol/l的尿素和5mol/l的盐酸胍可抑制酶的活性。核酸酶p1酶还具有3’-磷酸单酯酶的活性，可水解3’-单核苷酸、核苷二磷酸、和3’-二核苷酸的3’磷酸键，核酸酶p1酶常常用于制备5’-单核苷酸。 1.1.3 核糖核酸酶的结构性质

核糖核酸酶的二级结构含有两个独立的折叠结构域。每个结构域由一个内部的环区及其两侧的螺旋区组成。a环和b环含有高度保守的核苷酸序列，底物的切割位点在a环内。4个螺旋区的核苷酸序列可以有很大变化，其中a结构域的两个螺旋区h1和h2是与底物特异性结合的部位。a、b两个折叠结构域通过三级结构相互作用形成一个功能复合体。二价金属离子能够促进功能域相互作用。最近发现，惰性过渡元素钴的三价金属离子络合物co (nh3)63+及一些一价金属离子也能起到二价镁离子的作用。但一价金属离子不如镁离子有效，而且对镁离子有拮抗作用。但对co(nh3)63+却有协同作用。ph值对发夹状核糖核酸酶的反应速率影响很小，因此，金属离子不可能是因为结合了oh2而起到一般碱的催化作用。此外，切割位点的硫代磷酸修饰并不能抑制酶的活性，提示发夹状核糖核酸酶的催化机制与其它核糖核酸酶不同。由于核糖核酸酶种类的不同，其水解的rna、水解量、水解机理各不相同，所以表现出各种不同的性质。但主要性质也可归纳：①酶的热稳定性：55℃以下酶活力基本稳定，65℃大约有50%活力损失，该酶为锌酶，在酶液中补充锌离子可以提高酶的热稳定性。②zn2+浓度对酶热稳定性影响：酶液中加入不同浓度zn2+，70℃热处理20min，可以激活或强化5’-磷酸二酯酶的活性。③温度对酶活性的影响：70℃左右时酶的活力最高，温度升高或降低，酶活力下降。④酶的ph稳定性：酶液稳定的范围在ph5.0-ph8.0之间。⑤ph对酶活性的影响：除反应分别

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在醋酸缓冲液的各种ph条件下进行外,均按测酶活方法进行。ph值在5.0-6.0时酶的活力最高[3]。

1.1.4 核糖核酸酶的应用

大规模生产5’-核苷酸是的核糖核酸酶主要用途之一。5’-核苷酸是动植物性食物味道的基本成分，尤其是其中的鸟苷一磷酸(gmp)和肌苷一磷酸

(imp)，它们在大于或等于其域值时，呈现一种自身独特的美味；在其域值以下时，也可以增加其它食品的鲜味。以往作为食品鲜味添加剂的5’-核苷酸主要是从酵母浸出液的部分水解物得到的，但是这种途径生产5’-核苷酸的产量比较低(最大为6%)。而使用核糖核酸酶则可以把酵母浸出液生产5’-核苷酸的产量提高到20%左右。近年来对桔青霉等微生物所生产的核酸酶p1的毒理研究逐步深入，如g.a.burdock等人对核酸酶p1所导致的毒性和突变性研究揭示核酸酶对小白鼠没有毒性和致突变性，预测很快可以直接将微生物发酵生产的核酸酶p1用作食品添加剂。 1.2 核糖核酸酶的制备

工业上水解核酸用的核糖核酸酶多为从麦芽根中提取的核糖核酸酶，以及由桔青霉发酵得到的核酸酶p1。这两种制酶的方法制得的酶就酶活来说，发酵液酶活较麦芽根中提取的要高，但发酵法生产酶的成本比从麦芽根中提取酶的成本高。

1.2.1 从麦芽根中提取核酸酶

麦芽根是麦芽生产啤酒过程中的主要副产物，目前一般只用作饲料，但近年来随着研究的深入，发现麦芽根中不但蛋白含量高而且氨基酸组成合理。麦芽根占大麦总投量的3%，由于我国啤酒生产规模较大，麦芽根的数量相当可观。从麦芽根中提取5’-磷酸二酯酶的方法简单易行且含量丰富，所以常用从麦芽根中制得的核酸酶来水解核酸。w.f iers等的研究发现，采用干磨法粉碎的麦芽根，在ph2-8.5范围内，用水进行提取，ph对酶提取率影响极小，而提高离子强度，则能显著提高得率，得率提高数倍。在麦芽根的组成中，蛋白含量约为25%-35%，因此，蛋白质提取率不足30%。从蛋白质提取率来看，酶的提取尚有潜力。事实上，如何充分地将酶提取出来成为利用麦芽根核酸酶的一个首要问题，也是麦芽根利用经济性的重要前提。

通常采用一定离子强度的水从麦芽根中提取核酸酶，这有利于麦芽根中酶的溶出。溶出的酶为多种酶的杂酶液，由于核酸酶在zn2+存在的条件下热稳定性高，所以在杂酶液中加入zn2+，在70℃恒温水浴20min灭去杂酶，从而得到比较纯的核酸酶液。通过紫外分光光度法测得酶活。 主要流程如下：

麦芽根→粉碎→过筛→加水→调ph→加离子→恒温水浴→加znso4→灭杂酶→酶液

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1.2.2 从桔青霉发酵得到核酸酶p1

核酸酶p1的生产方法主要有3种：固体发酵法、深层液态发酵法以及固定化液体发酵法。固体发酵( solid2statefermentation，ssf)操作简单，成本低，利用麸皮等农作物为原料，也能够得到较高酶活的粗酶液。但是由于这些农产品成分非常复杂，因而，要想获得纯的核酸酶p1较为困难和繁琐。 深层液态发酵法利用现代发酵技术，通过装在发酵罐中的各种感应器，可以较好的控制发酵过程，其原料的配比也比较明确。通常的液体发酵主要工艺条件为：合成液体培养基，通风1∶0.4，发酵温度30℃，培养时间为50～70 h。不同生产厂家的工艺条件依据本身使用的菌种和设备有所调整。总体来说，液态发酵的菌丝体和发酵液较易分离，用于核苷酸发酵中。

近年来固定化液体发酵法在国外快速发展，将菌丝体固定在谷梗或其他一些惰性的材料上，重复使用，既提高了细胞的利用率和生物反应速率，也便于产物的分离。特别是利用某些惰性材料作为载体，可以在保持酶活的同时，简化发酵液的成分，便于核酸酶的提取和纯化。yang zhu等人研究了聚亚安酯惰性载体液体发酵生产核酸酶p1，并对惰性载体发酵条件进行了优化，结果表明酶产率比深层发酵提高4～20倍。

液体培养的流程：斜面培养→种子培养→发酵罐→酶液 固体培养的流程：斜面培养→种子培养→曲盘培养→浸取酶液 1.3 核糖核酸酶水解rna

核糖核酸酶水解核酸生成核苷酸，核酸降解产物的多少与核糖核酸酶的反应条件密切相关。水解反应只要在核糖核酸酶最适条件处反应水解核酸，得到的核苷酸的量就比较高。由于酶的不同核糖核酸酶的最适反应条件有所不同，一般来讲发酵酶液的最适条件为(1)最适反应温度：一般在70℃左右；(2) 最适反应时间：2小时左右；(3)最适反应ph值：5.0~5.5；(4)最适底物浓度：rna的浓度为2%左右；(5)最适酶活：每克rna需要4000u。而由麦芽根提得的酶最适作用条件为(1)最适反应温度：一般在67℃左右；(2) 最适反应时间：2小时左右；(3)最适反应ph值：5.5~6.0；(4)最适底物浓度：rna的浓度为2%左右；(5)最适酶活：每克rna需要3000u。根据最适反应条件设计实验。已知了核酸酶反应的各个最适条件，由于核酸酶的不同，核酸酶在水解核酸时的条件也不相同，所以在已知核糖核酸酶的大体反应条件的情况下，在各条件的附近设计不同水平的正交实验方案。根据不同因素不同水平选用不同的正交实验表，应用正交实验表上的各因素的组合进行实验得出数据，作出各因素的曲线图，若不能确定该因素的最适水平，再继续作未得出结果因素的正交实验，直到得出最适条件。将水解产物加沉淀剂沉淀离心，取上清液，用紫外分光光度计法测260nm处的紫外吸收值。同时用发酵得到的酶液进行正交实验设计，方法与提取酶液水解方法相同。 1.4 核苷酸的结构性质与检测

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1.4.1 核苷酸的结构性质

核苷酸是核酸的组成单位，它由三部分组成，分别为磷酸、戊糖和碱基。核苷酸按戊糖的种类不同，可以分为核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两种，其中核糖核苷酸是rna的组成单位，而脱氧核糖核苷酸则是dna的组成单位。组成rna的核糖核苷酸按照核苷酸分子碱基的不同，核苷酸可以分成四种，即5’-腺嘌呤核苷酸（amp）、5’-鸟嘌呤核苷酸(gmp)，5’-胞嘧啶核苷酸(cmp)和5’-尿嘧啶核苷酸(ump)。

5’-腺嘌呤核苷酸（5’-amp）分子量347.22，自丙酮水溶液中可得含有两分子水的结品。溶于热水，pk3.8(碱性基团)<1，6.2-6.4(磷酸根)。 5’-鸟嘌呤核苷酸（5’-gmp:）分子量363.23，含1/2分子水的结品，pk2.4(碱性基团)、9.4(酸性基团)<1，6.1(磷酸根)。熔点190-200℃(分解)。

5’-尿嘧啶核苷酸（5’-ump）分子量324.18，pk9.5(碱基上酸性基团) <1，6.4(磷酸根)。

5’-胞嘧啶核苷酸（5’-cmp)分子量323.21，熔点233℃(分解)。pk4.5(碱性基团)<1，6.3(磷酸根)。 四种核苷酸的结构式如下图所示：

实际使用中，四种核苷酸主要以钠盐形式存在。其形态均为无色至自色结晶或白色结晶性粉末，在保藏和应用中多为核苷酸的二钠盐。 1.4.2 核苷酸的检测

核酸水解产物核苷酸、核苷和碱基的分析方法，主要有光谱法（紫外光吸收法）、质谱法、色谱法（高效液相色谱法、离子色谱、反相高效液相色谱（rp-hplc）、薄层色谱）、电泳法（毛细管电泳）等。其中毛细管电泳和高效液相色谱法的分离能力最强，在细胞分离方面有广泛的用途，尤其是高效液相色谱法（hlpc）应用很多，紫外光吸收法应用方便，但准确率不高。离子交换液相色谱法具有较高的分离效率，但是需要对分离柱进行再生，分析的时间较长；反相液相色谱法具有快速、操作方便的特点，现有离子对反相和常规反相色谱，洗脱方法可采用等度洗脱，也可采用梯度洗脱。目前有许多关于核苷酸检测这方面的报道：张志国，贾云虹等用hplc和紫外检测方法对乳粉中的四种核苷酸cmp、ump、amp、gmp含量进行了检测，采用c-18柱，据报道结果完全符合要求。吉琼梅等人用0.05mol/l的kh2po4为流动相的高效液相色谱法测定了棉宝中的5’-amp、5’-cmp、5’-gmp、5’-ump的分解率。黄晓兰、李科德和陈云华报道采用反相高效液相色谱可以分离15种核酸的水解产物，并介绍了该方法在酵母抽提物中的应用。霍小敏、屠春燕等人用反规液相色谱和梯度洗脱模式对酵母rna降解的4中核苷酸进行了分离和检测。郑理、朱怀恩等人用紫外光吸收法对保健品中的核酸含量进行了测定[7]。邹耀洪、曹学增等对以