Western Blotting 流程详细版

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1， 收细胞。从细胞间取出要收样的细胞，可以用两种方式进行处理（处理前准备好碎冰，

并配好细胞裂解液，在所需量的细胞裂解液中加入leupeptin和PMSF，两者均为100X）： （1） 真空泵吸去培养基，加入预冷PBS洗一次，真空泵吸去残液（彻底吸干净）。

直接在板中加入裂解液（6孔板：100ul/well；6cm板：500ul/well；10cm板：

1.5ml/well），冰上静置5min。再吸入预冷的1.5mlEP管中，准备超声(10cm板的细胞裂解液请分装至2到3个EP管中，方便超声)。

（2） 真空泵吸去培养基，加入预冷PBS洗一次，真空泵吸净。再在板中加入PBS（6

孔板：500ul/well；6cm板：2ml/well；10cm板：5ml/well），用干净的细胞刮将

板中的细胞刮下，转移至1.5mlEP管中（推荐每个EP管500ul左右液体，方便超声）。2000r，5min，4℃。如果想尽可能多收细胞，可以在刮过的板里再重复加一次PBS（用量见前述），待之前的管离心之后，再加入，重复离心一次。离心之后，真空泵或移液枪吸去上清（用200ul tip头，尽可能吸干净）。加入裂解液（6孔板：100ul/well；6cm板：500ul/well；10cm板：1.5ml/well）。准备超声。

2， 超声破碎细胞。EP管置于冰上，每管按如下程序超声：超声时间1~2s/次，间隔5~10s

再重复下一次，总共10~20次。超声后的样品与未超声样品相比更澄清。超声效率推荐为20%，持续时间不宜过长，否则容易出现泡沫以及焦化现象。超声1~2s时，可以将EP管从冰上拿出，以便操作，超声后立即放回冰上。

3， 超声后离心，最大转速，30min，4℃。离心后将上清转入新的干净EP管中（沉淀可以

加入10ulSDS loading buffer混匀后，煮沸，跑胶，以验证目的蛋白是否残留于沉淀中，或是只存留于沉淀中）。蛋白样品必须一直置于冰上。 4， 需要的话，测定蛋白浓度。一般可用考马斯亮蓝蛋白浓度测定法（生工试剂盒，使用方法可见试剂盒说明书，或见下）：

准备好酶标板，以6孔板细胞收样为例，需要两排，8孔/排，一共16个酶标孔，在酶标板下面垫一张白纸。加入考马斯亮蓝染液200ul/孔。每一排的1~6孔依次加入各

1ul蛋白样品，用枪头轻轻混匀，即可见染液变蓝，蓝色越明显，则说明蛋白浓度越高（如果加入蛋白样品后颜色变化不明显，则将稀释度由200倍降到100倍，2ul样品/孔）。每排的第7孔加入1ul细胞裂解液。每排的第8孔加入1ul标准BSA蛋白溶液（浓度为1mg/ml），轻轻混匀，可见染液变蓝。

使用酶标仪测定读数，波长选择595nm。测定两次读数，在数据处理时取平均值即可。

数据处理：A 去除明显不可信的数值。取平均值进行计算。B 全部样品及标准BSA的数值减去裂解液的数值。也就是扣除背景。C 扣除背景后的全部样品的值除以扣除背景后的标准BSA的值，所得结果即为蛋白浓度（mg/ml）。D 再选取其中浓度最低的蛋白样品为上样最大量，根据总蛋白上样量一致的要求计算其他蛋白上样量。 5， 从上清中取出20~40ul（视上样量而定）到新的干净1.5ml EP管中，加入同样体积的SDS

loading buffer。100℃煮沸,10min。煮沸后的样品可以及时上样跑胶，也可保存在-20℃，隔天或隔段时间跑胶。未加BUFFER的蛋白样品也可以保存在-20℃当中。但尽量避免反

复冻融。

6， 配SDS-PAGE胶。先配分离胶，胶的浓度根据目的蛋白分子量而定，分子量越大，胶的

浓度越低，分子量越小，胶的浓度越大。hPYGO用10~12%即可。灌胶用1ml枪即可，灌

好之后及时压水，压水时要轻而均匀，以免分离胶的边界被压坏。

大概20min之后可以开始配积层胶。灌胶后记得及时插梳子，插梳子的时候不要用力过猛，以免液体飞溅出来。

配胶所用的APS尽量在一周内用完。SDS只需室温保存即可，若出现沉淀，则稍加热，即可溶解。

7， 分离胶配好约20min左右即可准备跑胶。装好跑胶仪，加上电泳缓冲液，注意观察是否

会漏液。如果漏液的话，需要卸下玻璃板重新装配。上样之前，装有蛋白样品的EP管最好用离心机甩一下，因为煮沸时管壁和管盖上会有凝结的水珠，不甩下来的话，可能

对样品浓度有影响。上样可以选用微量上样器或移液枪，如果想跑得比较好看点的话，建议所有上样孔均为同样上样体积，包括没有上样品的孔。跑胶一般积层胶部分50~60V，分离胶部分90~100V。或者也可以用恒流跑胶。注意正负极不要插错。接上电流后，注意看跑胶仪的底部，可以看到细小的泡泡向上升，这就表明已经开始跑胶，且正负极正确。另外，跑胶几分钟后，即可看到样品的上缘慢慢往下压，如果呈弥散状的话，说明正负极接反，马上停止跑胶，将正负极正确连接。

8， 跑胶时间大约1~2小时。之后进行转膜。提前十分钟左右配置转膜缓冲液。关掉电源，

打开跑胶仪，卸下玻璃板，用钢尺或塑料板轻轻橇开两块玻璃板，尽量使胶保持在短一点的玻板，比较方便切胶。根据预染MARKER的位置，用钢尺切下所需范围，在左下角切一个斜角，并量好大小，把胶浸入转膜缓冲液中，置于摇床上20min。戴上干净手套，用切纸机切下所需大小的PVDF膜，并相应地在左下角切角。把PVDF膜浸入甲醇一会儿，再放入转膜缓冲液，几分钟后即可用。把转膜要用的海绵和滤纸浸泡在转膜缓冲液中。 9， 把转膜仪的夹子打开，黑色一边朝下（负极），垫上一层海绵，一层滤纸（BIORAD原配

滤纸，如果是用自行剪的普通滤纸，则需要上下各5张），把胶铺在滤纸中央，用玻棒

轻轻压平，必要的话，可以倒一点点缓冲液，再用玻棒压平，压去气泡。去掉气泡后，再盖上PVDF膜，切角与胶相对应，同样也用玻棒压去气泡。之后再盖上一层滤纸，一层海绵然后把夹子合上，夹好，注意不要移动中间的夹层。按正负极的位置放进转膜仪。 把剩余的转膜缓冲液全部倒入转膜仪中，使转膜仪内部充满在缓冲液的环境中。然后盖上盖子（注意正负极），把转膜仪和电源都放在4℃冰箱里，接上电源，300mA，60~70min。 10， 转膜结束后，取出PVDF膜，根据膜上的预染MARKER的情况可以大约判定转膜情况

的好坏。牛奶或BSA封闭1h，封闭可以用杂交袋或是小培养皿，后者只要放在摇床上就

可以了。注意让膜全部浸入封闭液中。

11， 杂一抗。根据目的蛋白的量，杂一抗的时间从1.5h~overnight不等。杂完一抗后，

TBST洗膜，15min X 3次。如果觉得杂一抗的时间偏长，则可适当延长洗膜时间。洗膜时间尽量不要太短，以使背景干净。一抗记得回收。回收的一抗记得加叠氮钠（0.2%）。 12， 洗膜后杂二抗，45min~1h。TBST洗膜，15min X 3次。如果觉得杂二抗的时间偏长，则可适当延长洗膜时间。洗膜时间尽量不要太短，以使背景干净。二抗不需要回收，切勿加叠氮钠，因为会影响曝光。 13， 最后一次洗膜时即可开始准备曝光。准备好显影、定影两个盒子，以及装清水的一

个盒子，按顺序摆在桌子上。大小镊子各一把，剪刀一把，1.5ml EP管一个，1ml tip头

一盒，1ml移液枪一把，压片夹，垫上一张表面光滑的保鲜膜（这样不至于在曝光时留下印迹），ECL试剂盒。关好门，拉上窗帘，并用夹子夹住，确保暗室内无任何光源（除了红灯之外）。把PVDF膜放在一张干净的一次性手套上，在EP管中加入1：1体积的ECL的A液和B液，混匀，再滴加在膜上，由于液体的张力，混合液会聚在膜的表面形成一层，将膜包裹住。孵育时间5~10min，如果是表达量比较高的蛋白，孵育不到1min即可看到荧光条带，一般情况下3~5min可以慢慢看到荧光出现（在肉眼可见荧光的情况下，曝光时间大约5~10s即可，过长时间会令条带太粗而不清晰。但是肉眼看不到荧光并不代表曝不出来，曝光时间可设为3min、5min、10min，曝三次，一般能挑选出合适的一张）。孵育之后，将PVDF膜轻轻放在保鲜膜上，再将保鲜膜覆过来包住PVDF

膜，注意不要出现折痕。PVDF膜的切角应该位于右边（也就是反过来，这样的话，膜上结合蛋白的一面朝上）。将医学胶片剪成合适大小，切角，对应地放在膜上，压好压片机，开始计时。计时结束后将胶片取出放入显影液，轻轻晃动并在红灯下观察条带显影的情况。如果条带显影合适，则立即将胶片放入定影液。显影时间不宜过长，会变黑。在定影液中大概两三分钟，胶片即变成透明，这时可以放入清水中，结束曝光。曝光后的胶片用清水冲洗后晾干，保存。如果晾干后的胶片上有印渍，可以再用清水冲洗干净后重新晾干。

注意：在暗室中，未曝光的胶片不要离红灯太近。曝光结束离开暗室之前，先确认胶片盒已经收好。

附录： 溶液配方：

细胞裂解液1

Tris-HCl pH 7.5 20mM NaCl 150mM

EDTA(pH8.0) 1mM

EGTA(pH8.0) 1mM Triyton 1%

Sodium Pyrophosphate 2.5mM β-glycerophosphate 1mM Sodium Orythovanadate 1mM

10mmol PMSF溶液 PMSF 0.174g 异丙醇

leupeptin PBS

NaCl 8g KCl 0.2g

Na2HPO4 1.42g

KH2PO4 0.27g

加水约800~900ml溶解，浓盐酸调PH值至7.4。

10%SDS

SDS 10g

加水约80~90ml，加热约50度左右溶解后，定容至100ml。 10%APS APS 0.1g 超纯水1ml

SDS-PAGE浓缩胶

SDS-PAGE分离胶

1X电泳缓冲液（5L） Tris base 15g Glycine 72g

SDS 10g

加水溶解，并定容至5L。

转膜缓冲液

Glycine 14.42g Tris base 3.02g

10%SDS 2ml（可加可不加）

加水溶解至850ml，再加150ml甲醇，混匀即可，总体积为1L。

10% tween 20（200ml）

Tween 20 20ml（用25ml量筒量取）

加水溶解至200ml，棕色瓶避光4℃保存。

10X TBS（1L） Tris base 24.2g

NaCl 80.1g

加800~900ml水溶解，浓HCl调PH值至PH7.6，定容至1L。

TBST（1L） 10XTBS 100ml 10% tween 20 10ml 加水定容至1L

封闭液

5%BSA或5%牛奶 TBST 1ml

BSA or MILK 0.05g