实验一 大肠杆菌感受态制备及转化
一 实验目的
通过本实验学习掌握氯化钙法制备大肠杆菌感受态和质粒转化方法。 二 实验原理
1. 用氯化钙处理处于对数生长期的大肠杆菌（Escherichia coli），可使细菌具有接受外源DNA的能力，即感受态细胞。 2. 热激处理可使DNA导入细胞。 三 实验材料：大肠杆菌 质粒pUC18 四、实验用具和药品 1. 实验用具:
摇床，低温离心机，移液器及枪头，玻璃试管，离心管（1.5mL），三角瓶100ml， 2. 实验试剂： ①LB 液体培养基 10g/L 氯化钠 10/L 蛋白胨 5/L 酵母提取物
用0.1M NaOH调pH至7.2， 121℃高温灭菌15min，
② LB固体培养基：LB液体培养基加1.5%琼脂粉，121℃高温灭菌15min，冷却至60℃左右，加终浓度为100mg/L的氨苄青霉素。
③氯化钙溶液：将固体溶于适当体积的蒸馏水中，浓度为60mM， 121℃高温灭菌15min，放臵于4℃备用。 五 实验步骤
（一）感受态细胞制备
1. 挑取划线的大肠杆菌DH5?菌种的单克隆菌落到3mL液体LB培养基,37℃过夜振荡（200r/min）培养。
2. 取过夜培养的菌液1ml，转入50mL LB培养液中，振荡（200r/min）培养至O.D.600=0.5。
3. 取3ml菌液，冰上放臵10min，4℃，1800g 离心5分钟；
4. 4℃，1800g 离心5分钟；菌体加1ml 预冷的氯化钙溶液，轻轻重悬！ 5. 4℃，1800g 离心5分钟；4℃，1800g 离心5分钟； 6. 加1ml 预冷的氯化钙溶液，轻轻重悬，冰上放臵30min； 7. 4℃，1800g 离心5分钟，用0.1ml轻轻重悬。 （二）转化
1. 取1μl pUC18质粒，轻轻混匀； 2. 冰上放臵15min； 3.42℃热激90sec 4. 冰上放臵2-5min；
5.加LB培养液1ml，37℃振荡（200r/min）培养30min；
6. 取菌液100μl，涂布于含氨苄青霉素100mg/L的LB固体培养基上； 7. 37℃培养过夜。
8. 菌落数计数，计算转化效率（10X 个菌落/1μg质粒）。 六 实验作业
1.大肠杆菌感受态细胞制备的关键步骤是什么？ 3. 结合课程所学简述pUC18质粒的主要特点。 2. 计算质粒转化效率 3. 附上图片。
实验二 重组蛋白诱导表达及纯化
一 实验目的
1. 掌握重组蛋白诱导表达的方法； 2. 亲和层析法纯化His 标记的融合蛋白 二 实验原理
将目的基因连接在表达载体后，通过加入诱导剂IPTG诱导目的基因表达。表达载体除具有蛋白表达所需要的启动子外，在终止子前有6个His编码序列，便于蛋白的亲和层析纯化。
图2-1 pET28a 质粒图谱
亲和层析以蛋白质或生物大分子和结合在介质上的配基间的特异亲和力为基础。本实验采用Ni-NTA beads和结合有Ni2+的磁珠在变性或非变性条件下对融合蛋白进行分离纯化，只需通过“结合－清洗－洗脱”三个简单的操作步骤就可完成。该系统可根据样本量灵活调整beads用量，从而进行小量和大量蛋白纯化，并且beads可以再生使用。
图2-2 Ni-NTA亲和纯化原理
三 实验材料：大肠杆菌 质粒pET28a，Ni-NTA 填充料 四、实验用具和药品 1. 实验用具:
摇床，离心机，移液器及枪头，三角瓶100ml，离心管（1.5mL），离心式纯化柱。 2. 实验试剂： ①LB 液体培养基 10g/L 氯化钠 10/L 蛋白胨 5/L 酵母提取物 用0.1M NaOH调pH至7.2 ② 抗生素配制：
称取适量卡那霉素溶于灭菌的双蒸水中，终浓度为20 mg/ml，0.22μM滤膜过滤除菌，放臵于-20℃冰箱备用；
称取适量氨苄青霉素溶于灭菌的双蒸水中，终浓度为100mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌，放臵于-20℃冰箱备用；
称取适量氯霉素溶于甲醇溶液中，终浓度34 mg/ml，放臵于-20℃冰箱备用。 ③诱导剂IPTG溶液：
用灭菌的双蒸水配制1mmol/ml IPTG，0.22μM滤膜过滤除菌，放臵于-20℃冰箱备用； ④纯化溶液配制 溶液A
20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl 溶液 B
20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 20mM Imidazole(咪唑) 溶液C
20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5M NaCl, 250 mM Imidazole(咪唑) 五 实验步骤
（一）蛋白的诱导表达
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